国产商清国产精品国产k_囯产亚州中文字幕日韩在线_国产福在线永久视频_欧美日有码视频√_天天躁夜夜躁狠狠久久kk_日韩中文字幕精品在线观看_毛片a级三毛片免费播放_亚州精品中文字幕乱码三区_国产在线电影一区_国产AV青青大帝

您好,歡迎光臨上海雅吉生物商城!
工作時(shí)間:9:00-18:00
全國(guó)服務(wù)熱線:021-34661276

細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)

發(fā)布時(shí)間:2020/9/28 9:25:24      閱讀次數(shù):880

 

實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)晚期,以培養(yǎng)基制備高濃度細(xì)胞懸液,加入細(xì)胞保護(hù)劑,等份轉(zhuǎn)移至凍存管中,緩慢冷凍。

 

細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑,即終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點(diǎn)降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細(xì)胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開(kāi)始為-1 到 -2℃/min,當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

 

實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞

試劑、試劑盒

胰蛋白酶 BSS DMSO

儀器、耗材

吸管 離心管 玻璃安瓿 酒精燈 線繩 紗布口袋 搪瓷罐

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 肉眼及顯微鏡觀察,確保細(xì)胞滿足冷凍標(biāo)準(zhǔn)。

 

2.使細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期,若為貼壁細(xì)胞,用胰酶消化,并進(jìn)行細(xì)胞技數(shù)。若為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并離心。

 

3.懸浮細(xì)胞的濃度為:2×106個(gè)~2×107個(gè)細(xì)胞/ml。

 

4.將以下任意一種細(xì)胞保護(hù)劑加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,配制凍存液:

(a) 加10%~20%的二甲基亞砜(DMSO)或(b)加20%~30%甘油。

 

5. 用凍存液將細(xì)胞懸液按1:1的比例稀釋至細(xì)胞度濃約為1×106 ~1×107 /ml ,此時(shí)DMSO的濃度為5%-10%(或甘油濃度為10-15%)。建議勿將凍存管置于冰上,減少細(xì)胞退化。使用DMSO時(shí),室溫操作30min是無(wú)害的,當(dāng)使用甘油時(shí),則對(duì)細(xì)胞是有益的。

 

6. 將細(xì)胞懸液分裝至預(yù)先標(biāo)記好的凍存管中,蓋上蓋子,擰緊,密封,注意不要太緊,避免螺旋扭曲變形。

 

7. 將凍存管夾在鋁條上,裝入儲(chǔ)存筒中,或?qū)⑵渌缮⒌嘏帕性诔閷蟽?chǔ)存器中。

 

8. 將凍存管通過(guò)上述方法之一以1℃/min的速率進(jìn)行冷凍。使用隔熱保溫的方法,使凍存管達(dá)到-70℃,若最初溫度為20℃,則需4~6h,但好于-70℃過(guò)夜。

 

9.當(dāng)凍存管溫度達(dá)到-70℃或更低時(shí),在將其從-70℃或能控制冷凍速率的冷凍柜中轉(zhuǎn)移出來(lái)之前,檢查冷凍記錄,確定液氮罐中存放凍存管的合適位置。

 

10. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮冷凍罐中,好不要使其浸沒(méi)在液氮中,將放油凍存管的鋁條和紙質(zhì)管放入預(yù)先確定的儲(chǔ)存筒中,或?qū)(gè)別凍存管放入預(yù)先確定的抽屜中。該步驟必須迅速(<2min),因?yàn)閮龃婀軙?huì)以越10℃/min的速度升溫,如果溫度上升超過(guò)-50℃,細(xì)胞會(huì)迅速惡化。

注意事項(xiàng)

1.二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,包括皮膚和橡膠手套 。因此,應(yīng)謹(jǐn)慎處理。

 

2.將凍存管放入液氮時(shí),必須使用保護(hù)性手套和面罩。

 

其他 1.  為保持細(xì)胞最大存活率,一般都采用慢凍存融的方法。

2.  凍存物距液氮面越近溫度越低。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為-1℃~12℃/分鐘,當(dāng)溫度下降達(dá)-25℃時(shí),下降速度可增至-5~-10℃/分鐘,到-100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度,過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促冰晶形成。

3.  初次凍存者在下降凍存時(shí),宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置,然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法,以觀測(cè)下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系,當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后,僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

4.  各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣;上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些,骨髓干細(xì)胞-2~-3℃/分鐘合適;胚胎細(xì)胞耐受性較小,不宜太快?傊谝婚_(kāi)始時(shí),下降速度不能超過(guò)-10℃/分鐘。

5.  用什么防護(hù)劑合適和用量多大,要依細(xì)胞而定,初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好,一般細(xì)胞可用甘油;用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6.  原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年,但為妥善起見(jiàn),凍存一年后,應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次,然后再繼續(xù)凍存。





 


微信客服
掃一掃立即咨詢


微信客服
掃一掃立即咨詢

銷售電話:

021-34661275

021-34661276

15301693058