二、昆蟲(chóng)蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS)是一個(gè)二元系統(tǒng)。第一個(gè)部分是病毒感染的昆蟲(chóng)宿主，通常是鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系，有時(shí)也可以是鱗翅目的昆蟲(chóng)。第二個(gè)部分是桿狀病毒表達(dá)載體，其功能是將編碼目標(biāo)蛋白的外源基因?qū)�入宿主�?xì)胞中、組裝桿狀病毒并進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。
1.昆蟲(chóng)細(xì)胞
鱗翅目昆蟲(chóng)(Order Lepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶(butterfly)，它們是桿狀病毒家族中多種病毒的宿主。目前已經(jīng)建立了超過(guò)250種的昆蟲(chóng)細(xì)胞株。桿狀病毒表達(dá)載體涉及的最常用的鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)細(xì)胞株有兩個(gè)，其中一個(gè)是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亞克隆IPLB-SF-21而建立的。IPLB-SF-21細(xì)胞系是在1977年從草地貪夜蛾(又稱(chēng)為秋天行軍蟲(chóng))蛹的卵巢組織中分離出來(lái)的；另外一個(gè)是HighFive, 最初是從粉紋夜蛾(又稱(chēng)為甘藍(lán)銀紋夜蛾)(cabbageIooper)的成熟卵巢組織中分離到的細(xì)胞株。

細(xì)胞	來(lái)源	用途
Sf9	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細(xì)胞系IPLB-SF21-AE分離得到的克隆	適于轉(zhuǎn)染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達(dá)重組蛋白，使用最廣泛
Mimic Sf9	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細(xì)胞系IPLB-SF21-AE分離得到的克隆	適于轉(zhuǎn)染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達(dá)重組蛋白，具有更完整的N-糖基化途徑，在含有血清的培養(yǎng)液中能夠表達(dá)出人源化的重組糖蛋白。
Sf21	從草地貪夜蛾蛹(Spodoptera frugiperda)的卵巢組織所得細(xì)胞系IPLB-SF21-AE衍生所得的克隆	適于轉(zhuǎn)染、生產(chǎn)高滴度病毒以及表達(dá)重組蛋白。Sf21細(xì)胞可能比Sf9細(xì)胞表達(dá)蛋白量更高。
HighFive	來(lái)源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的成熟卵巢組織	轉(zhuǎn)染效率偏低，不建議作為bacmid的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；但是一旦得到重組病毒，HighFive細(xì)胞表達(dá)重組病毒性能優(yōu)越，更適合表達(dá)分泌型重組蛋白。

Sf9/Sf21和HighFive兩種細(xì)胞系都能以貼壁或懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。通過(guò)感染在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的 Sf9/Sf21或 HighFive細(xì)胞，可以很方便地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的目的。昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)的條件和方法與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法不太一樣，昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)溫度是25-30℃，最適溫度是28℃而不是37℃；另外，Sf9/ Sf21和HighFive細(xì)胞貼壁不緊, 在傳代培養(yǎng)時(shí)不需要EDTA或胰酶(trypsin)處理；昆蟲(chóng)細(xì)胞的生長(zhǎng)也不需要CO₂培養(yǎng)箱，因?yàn)槔ハx(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液通常是用磷酸鹽而不是碳酸鹽作為緩沖液。Sf9/Sf21和HighFive細(xì)胞都可以在有或沒(méi)有血清的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。多種不同的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液都能夠從多個(gè)不同的制造商買(mǎi)到，其中包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。有血清培養(yǎng)液主要有Grace's insect cell culture medium，TNM-FH，IPL-41,TC-100和Schneider's insect medium等，而無(wú)血清培養(yǎng)液主要有SF-900II SFM，SF-900III SFM和Express-Five SFM等特別適合蛋白的大規(guī)模表達(dá)。需要指出的是，Sf9/Sf21和HighFive細(xì)胞都會(huì)傾向于逐漸適應(yīng)某種特定的培養(yǎng)液，如果突然將它們的培養(yǎng)液從有血清培養(yǎng)液變?yōu)闊o(wú)血清培養(yǎng)液時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的損失。因此通常建議采用"緩慢培養(yǎng)液更換法"，如在連續(xù)傳代中，應(yīng)該將無(wú)血清培養(yǎng)液的比例從0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用這種相對(duì)緩慢的血清戒除法，當(dāng)將細(xì)胞剛剛置于不含血清的培養(yǎng)液時(shí)，這些細(xì)胞也會(huì)經(jīng)歷短暫的生長(zhǎng)停止或生長(zhǎng)緩慢，但這些細(xì)胞會(huì)在新培養(yǎng)液中緩慢生長(zhǎng)12天后恢復(fù)至正常的生長(zhǎng)速率。"緩慢培養(yǎng)液更換法"不僅可實(shí)現(xiàn)從有血清培養(yǎng)液到無(wú)血清培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)換，還可以用于將昆蟲(chóng)細(xì)胞從一種無(wú)血清培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到另一種無(wú)血清培養(yǎng)液。
昆蟲(chóng)細(xì)胞可作為桿狀病毒感宿主而進(jìn)行高水平的外源蛋白的表達(dá)，來(lái)自昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白通常具有正確的翻譯后修飾和生物學(xué)活性，其翻譯后蛋白修飾狀態(tài)與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，當(dāng)然這種加工與哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的加工并不總是相同，比較明顯的一個(gè)例子就是蛋白的N-糖基化修飾有所不同。Invitrogen將一個(gè)最初命名為SfSWT-I的源于Sf9細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞系命名為Mimic Sf9, 該細(xì)胞系具有更完整的N-糖基化途徑，在含有血清的培養(yǎng)液中能夠表達(dá)出人源化的重組糖蛋白。
2. 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
與大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等其它常用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：
(1) 與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，對(duì)于某些容易在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中由于二硫鍵錯(cuò)誤配對(duì)或者缺乏蛋白翻譯后修飾(如磷酸化和糖基化等)而形成包涵體的蛋白，在大多數(shù)情況下，在昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)的重組蛋白往往可溶，而且能折疊正確，并且含有對(duì)某些蛋白活力所必須的翻譯后修飾(如磷酸化和糖基化等)。
(2) 與酵母和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，外源基因表達(dá)水平高，非常適應(yīng)大規(guī)模表達(dá)所需的高密度懸浮培養(yǎng)，而且比較容易分離純化。
(3) 昆蟲(chóng)細(xì)胞由于懸浮生長(zhǎng)，容易進(jìn)行放大培養(yǎng)，從而可進(jìn)行大規(guī)模的重組蛋白表達(dá)純化，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于科研和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，重組蛋白產(chǎn)量最高可達(dá)1g/L。
(4) 昆蟲(chóng)細(xì)胞可用于同時(shí)表達(dá)多種重組蛋白，可通過(guò)多種重組病毒同時(shí)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞或用含有多個(gè)表達(dá)框的一種病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。所以該系統(tǒng)特別適合表達(dá)多亞基的蛋白復(fù)合物以進(jìn)行蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究等。
(5) 生物安全性高。昆蟲(chóng)桿狀病毒具有嚴(yán)格的宿主范圍，通常僅限于非脊椎動(dòng)物，因此具有生物安全性高這一特點(diǎn)。
3. Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是由Luckow等人于1993年發(fā)展的一種快速有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法，也是到目前為止使用最為廣泛的昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要包括以下兩個(gè)組分：(1) 用于插入目的基因的pFastBac載體，在該系列載體中，目的基因的高水平表達(dá)由Autographa californica多核多角體病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角體啟動(dòng)子(polyhedrin(P_H)promoter)驅(qū)動(dòng)。載體多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)均為T(mén)n7元件，同時(shí)還含有一個(gè)慶大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal。(2)含桿狀病毒穿梭載體bacmid (bMON14272, 136kb)和輔助質(zhì)粒(helper plasmid，用于表達(dá)轉(zhuǎn)座必須的轉(zhuǎn)座蛋白) pMON7124的大腸桿菌DH10Bac宿主菌株。Bac-to-Bac昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)利用遺傳轉(zhuǎn)座(genetic transposition)得到重組病毒。DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F復(fù)制子，卡那霉素抗性基因，mini-attTn7位點(diǎn)和lacZα互補(bǔ)因子(可通過(guò)藍(lán)白斑篩選)；輔助質(zhì)粒pMON7124包含四環(huán)素抗性和tnsABCD區(qū)域，該區(qū)域表達(dá)轉(zhuǎn)座反應(yīng)所需的轉(zhuǎn)座蛋白。當(dāng)pFastBac重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH10Bac細(xì)胞后，pFastBac載體上的mini-Tn7位點(diǎn)和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位點(diǎn)之間發(fā)生轉(zhuǎn)座(transposition)，產(chǎn)生重組bacmid。該轉(zhuǎn)座會(huì)導(dǎo)致bacmid上的LacZ基因的破壞，因此可以通過(guò)在細(xì)菌培養(yǎng)平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選來(lái)鑒別含有重組bacmid的DH10Bac菌落，從白色菌落的DH10Bac克隆中可分離出含有編碼目的基因的重組bacmid DNA，后者進(jìn)一步感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后可產(chǎn)生含有重組子的桿狀病毒即可啟動(dòng)外源重組蛋白的表達(dá)。表達(dá)目的蛋白的桿狀病毒在被擴(kuò)增和滴度測(cè)定后，高滴度的桿狀病毒即可用于感染昆蟲(chóng)細(xì)胞以進(jìn)行大規(guī)模的目的蛋白的表達(dá)。
4. Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)步驟
(1)把目的基因克隆至pFastBac系列載體產(chǎn)生重組質(zhì)粒。根據(jù)pFastBac系列載體的多克隆位點(diǎn)選做合適的酶切位點(diǎn)，按照讀碼框插入待表達(dá)的目的基因序列。最后通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入序列是否正確。
(2)轉(zhuǎn)化pFastBac重組質(zhì)粒到DH10Bac大腸桿菌中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。可以選擇pFastBac1-EGFP (D2802)作為對(duì)照質(zhì)粒，可以選購(gòu)DH10Bac甘油菌(D0346)用于制備感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后利用藍(lán)白斑篩選重組菌株。重組菌株由于轉(zhuǎn)座會(huì)導(dǎo)致LacZ基因的破壞而呈現(xiàn)白斑，用于藍(lán)白斑篩選的LB瓊脂糖平板應(yīng)含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。
(3)選做：挑取白斑，重新劃線(xiàn)以確認(rèn)獲得的白色克隆是真實(shí)的白斑。平板含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
(4)挑取白斑，培養(yǎng)過(guò)夜。須使用含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素和10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)液。
(5)小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA。推薦使用桿狀病毒穿梭載體bacmid小量提取試劑盒(D0031)提取重組bacmid DNA。重組Bacmid DNA應(yīng)該分裝凍存于-20℃，因?yàn)榉磸?fù)凍融會(huì)導(dǎo)致bacmid斷裂等從而顯著降低其轉(zhuǎn)化效率。如兩星期內(nèi)使用，可保存于4℃。
(6) 重組bacmid的PCR鑒定。利用 PCR反應(yīng)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。PCR 反應(yīng)所用引物為pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)座的bacmid其所擴(kuò)增所產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度為350bp，重組bacmid擴(kuò)增所產(chǎn)生的片段的長(zhǎng)度為350bp加上插入片段的長(zhǎng)度。
(7)重組bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞。推薦使用生產(chǎn)的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)染試劑LipoInsect™ (C0551)，將提取的重組Bacmid轉(zhuǎn)染進(jìn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞。建議使用Grace's Insect Cell Culture Medium培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)如果使用的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)染試劑LipoInsect™，實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞核開(kāi)始變大；轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)，細(xì)胞慢慢停止生長(zhǎng)、脫落，細(xì)胞表面長(zhǎng)出芽孢狀結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)染后72小時(shí)候細(xì)胞開(kāi)始裂解，此時(shí)病毒開(kāi)始釋放到培養(yǎng)液中。如果同時(shí)轉(zhuǎn)染了pFastBac1-EGFP (D2802)，在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后可以觀察到大部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染后96小時(shí)幾乎所有的細(xì)胞都呈現(xiàn)綠色熒光，這樣可以作為整個(gè)病毒包裝體系的陽(yáng)性對(duì)照。
(8)收集P1代桿狀病毒。轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，收集培養(yǎng)液上清，500g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞和細(xì)胞碎片，取上清即為P1代桿狀病毒。此時(shí)病毒滴度通常為1X10⁶-1X10⁷pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分裝于含2% FBS的培養(yǎng)液中后在-80℃較長(zhǎng)期保存。反復(fù)凍融會(huì)大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
(9)P1代桿狀病毒的擴(kuò)增。P1代病毒再次感染昆蟲(chóng)細(xì)胞可獲得P2代病毒。如果采用懸浮培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，建議使用10ml培養(yǎng)液并且控制細(xì)胞密度為2X10⁶/ml；如果使用6孔板貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞密度應(yīng)為2X10⁶/well，MOI (multiplicity of infection)為0.05-0.1(即每100個(gè)細(xì)胞用5-10pfu的病毒進(jìn)行感染)。28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)后，70-80%的細(xì)胞死亡時(shí)，收集細(xì)胞和上清，500g離心5分鐘，取上清即為P2代病毒。此時(shí)病毒滴度約為1X10⁷-1X10⁸pfu/ml。可收集本步驟離心后的細(xì)胞碎片沉淀，加入適量的1X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(P0015A)，裂解后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測(cè)，以分析確定目的蛋白是否已經(jīng)正常表達(dá)。
(10)選做：P2代桿狀病毒的擴(kuò)增。如果P2代病毒滴度仍然偏低，可對(duì)P2代病毒再次進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增方法同P2代病毒的擴(kuò)增方法。P2代病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后最終會(huì)獲得滴度更高的P3代病毒。
(11)病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白的大規(guī)模表達(dá)。可選擇Sf9/Sf1/HighFive的任何一種細(xì)胞株進(jìn)行蛋白大規(guī)模表達(dá)。但如果表達(dá)的是分泌蛋白，建議選用HighFive。建議在昆蟲(chóng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行病毒感染，此時(shí)細(xì)胞密度在1X10⁶/ml -2X10⁶/ml為佳，MOI可從5-10開(kāi)始嘗試。建議在不同的時(shí)間階段，如感染后24、48、72或96小時(shí)收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，SDS-PAGE并進(jìn)行Western Blot檢測(cè)以確定最佳的停止蛋白表達(dá)的時(shí)間。因?yàn)槔ハx(chóng)細(xì)胞內(nèi)有很多蛋白酶，表達(dá)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表達(dá)高峰通常在感染后30-72小時(shí)，而非分泌蛋白的表達(dá)高峰通常在感染后48-96小時(shí)。
5. 目的蛋白的純化
利用pFastBac1進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)的時(shí)候，根據(jù)蛋白純化方式的需要以及融合表達(dá)目的蛋白以提高其表達(dá)量的需要，可以在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)添加His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標(biāo)簽影響目的蛋白的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)研究，可在融合蛋白和標(biāo)簽之間添加蛋白酶酶切位點(diǎn)，如TEV或PreScission的酶切位點(diǎn)。昆蟲(chóng)表達(dá)蛋白的純化步驟和大腸桿菌表達(dá)蛋白的純化步驟基本一致。如果蛋白主要以可溶形式表達(dá)，離心收集昆蟲(chóng)細(xì)胞，超聲裂解細(xì)胞，但由于昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶種類(lèi)比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。推薦使用His-tag Purification Resin 進(jìn)行His標(biāo)簽蛋白的純化，推薦使用 GST-tag Purification Resin進(jìn)行GST標(biāo)簽蛋白的純化，同時(shí)可以利用離子交換、分子篩層析等進(jìn)一步純化目的蛋白。可以使用PreScission Protease 或者TEV Protease進(jìn)行柱上酶切或者洗脫后酶切(如果使用TEV Protease，我們推薦使用洗脫后酶切)以取代蛋白標(biāo)簽。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當(dāng)濃縮后保存等。