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檢測技術(shù)的又一法寶——超敏一步巢式Taqman qPCR

發(fā)布時間：2021/3/23 9:58:55 閱讀次數(shù)：575

巢式PCR具有很高的靈敏度和特異性，但傳統(tǒng)的巢式PCR采用兩對引物，通過兩輪PCR，進行目標產(chǎn)物的擴增。這種操作的不便性，使得其高靈敏度的特性難以應用到快速檢測和臨床診斷中。在單管巢式PCR的擴增中，由于內(nèi)側(cè)引物會阻礙外側(cè)引物的擴增，因此標準的Taq DNA聚合酶不能在單管巢式PCR的擴增中，發(fā)揮其高靈敏度的特性。采用耐高溫、且具有鏈置換活性的聚合酶，可保證在單管反應中，內(nèi)外兩側(cè)引物同時擴增，巢式PCR才能達到真正意義上的高靈敏度。一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技術(shù)最早報道于2013年，雖然其擁有高靈敏度的檢測特性，但始終未能在核酸檢測領(lǐng)域獲得廣泛應用。其主要原因是SD聚合酶的鏈置換活性過于強烈，而導致外切酶活性作用的機會太弱，導致高信噪比的TaqMan探針無法應用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的熒光探針檢測只能依靠特異性和信噪比欠佳的發(fā)卡FRET探針。
憑借在分子工具酶改造工作中積累的的豐富經(jīng)驗，開發(fā)出具有探針切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，結(jié)合獨有的P-Bond錨定探針技術(shù)，將高信噪比的TaqMan探針應用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested qPCR方法。運用TaqMan One-Step Nested PCR方法檢測DNA或RNA分子，在檢測靈敏度和擴增速度方面，都是傳統(tǒng)TaqMan PCR法難以企及的。因此，TaqMan One-Step Nested PCR技術(shù)將是未來基因檢測市場爭奪戰(zhàn)中的最有利武器之一。

一、One-Step Nested PCR 高靈敏度機理

在標準PCR過程中，使用上游和下游兩條引物對靶基因進行熱循環(huán)擴增，每經(jīng)過一個循環(huán)的擴增，產(chǎn)物最多變?yōu)?倍。而在One-Step Nested PCR(或稱為PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的擴增中由于使用兩條上游引物和兩條下游引物，因此在每次熱循環(huán)過程中，產(chǎn)物增加近4倍，在經(jīng)過30-40次循環(huán)后，核酸產(chǎn)物將會高于PCR法成千上萬倍，并且所需的循環(huán)數(shù)更少。在核酸檢測的實驗中，One-Step Nested PCR法比標準PCR法靈敏度要高10-100倍，并且更容易開發(fā)出高靈敏的檢測試劑盒。

二、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術(shù)

TaqMan One-Step Nested qPCR技術(shù)是在PCDR的基礎(chǔ)上，研發(fā)團隊利用具有探針切割活性的SD2.0或SD3.0 DNA/RNA聚合酶，結(jié)合獨特的P-Bond探針錨定技術(shù)開發(fā)的一項新的核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)較目前核酸檢測工作中常用的Taqman qPCR技術(shù)，在靈敏度和擴增速度上，具有極大的優(yōu)勢，因此該技術(shù)在目前和未來的核酸檢測領(lǐng)域具有極大的推廣和應用價值。

TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能對比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
擴增引物數(shù)	兩條	四條或六條
探針	雙標熒光探針	雙標P-Bond熒光探針
熱循環(huán)倍增數(shù)	<2	>2
擴增條件	熱變性循環(huán)	熱變性循環(huán)
檢測設(shè)備	標準定量PCR儀	標準定量PCR儀
數(shù)據(jù)判讀方式	擴增曲線或Ct值	擴增曲線或Ct值
對模板變異敏感度	較敏感	不敏感
5 copy靈敏度	開發(fā)難度大，判讀困難	開發(fā)容易，判讀容易
5 copy Ct值	通常>34	通常<28
DNA擴增用酶	Taq	SD 2.0
RNA擴增用酶	Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05	SD 3.0

三、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術(shù)應用策略

在TaqMan One-Step Nested PCR的實驗中，采用4條擴增引物的情況下，檢測靈敏度和擴增速度較傳統(tǒng)TaqMan PCR法會大幅提高。同時，由于采用了4條擴增引物，當在檢測變異度較高的RNA病毒時，突變對擴增引物的影響顯著降低，從而避免了漏檢的可能性。當再增加一條檢測探針時，對突變的敏感度進一步降低，此時已經(jīng)與TaqMan PCR的雙重檢測防止漏檢的設(shè)計完全相同，但One-Step Nested PCR法檢測靈敏度更高。為了進一步提高檢測靈敏度和擴增速度，可以再增加一對擴增引物，采用6引物進行擴增。

圖：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探針設(shè)計原理

四、TaqMan One-Step Nested qPCR的引物和探針設(shè)計原則

表 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物設(shè)計參數(shù)對比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
擴增引物長度	18-26bp，條件完全相同
擴增引物TM值	55-60℃，條件完全相同（GC含量40-60%最佳
探針長度	20-35bp	20-28bp
探針TM值	一般68℃（>引物10℃）	一般63℃（>引物3-5℃）
擴增片段大小	<200bp	<300bp（外側(cè)）
		<150bp（內(nèi)側(cè)）
探針位置	與引物3’端間隔2-6bp	與引物3’端間隔4-20bp

五、TaqMan One-Step Nested PCR的擴增性能展示

1.以非洲豬瘟DNA病毒核酸檢測為例，進行TaqMan One-Step Nested PCR與TaqMan PCR兩種方法性能的比較。


圖A：傳統(tǒng)的TaqMan PCR法對10copy以下模板檢測困難，通常Ct>35，不易判讀。		圖B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，單copy分子Ct<30. 結(jié)果易于判讀。

2.以2019-CoV RNA病毒核酸檢測為例，應用TaqMan One-Step Nested PCR進行檢測。

圖A:針對2019-CoV的N基因使用的引物、探針策略圖示


圖B：2019-CoV的N基因靶標區(qū)段1（FAM通道）靈敏度測試		圖C：2019-CoV的N基因靶標區(qū)段2（HEX通道）靈敏度測試

3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或變異毒株的分型檢測。

一步巢式Taqman qPCR檢測新冠病毒核酸D614G突變

圖A:針對2019-CoV的S基因的D614G突變使用的引物、探針策略圖示


圖B：2019-CoV病毒 D614G分型結(jié)果		圖C：2019-CoV病毒D614（野生型）靈敏度測試		圖D：2019-CoV病毒G614（突變型）靈敏度測試