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核酸恒溫檢測(cè)技術(shù)概覽

發(fā)布時(shí)間：2021/3/23 10:04:21      閱讀次數(shù)：501

 

一、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀
自1980年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明后，基于PCR技術(shù)的核酸檢測(cè)迅速應(yīng)用到臨床、食品、環(huán)境的檢測(cè)中，并成為核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但PCR的檢測(cè)技術(shù)存在設(shè)備體積大、粗樣品耐受性差、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度難以達(dá)到單copy等諸多缺點(diǎn)，已經(jīng)難以滿足現(xiàn)代核酸檢測(cè)的要求：速度快（<30min）、超靈敏度（1-5copy/test）、大體積粗制樣品直檢（20-50%反應(yīng)體積樣本量）、野外操作、簡(jiǎn)單化操作等方面的指標(biāo)。 在過去的20年中科學(xué)家一直嘗試通過恒溫?cái)U(kuò)增的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，這其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
在這些恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，以2000年首次報(bào)道的LAMP法尤為耀眼和引人關(guān)注，目前占據(jù)超過60%的恒溫檢測(cè)市場(chǎng)。核酸檢測(cè)對(duì)LAMP技術(shù)如此親賴，究其原因，得益于其它恒溫檢測(cè)技術(shù)難以達(dá)到LAMP技術(shù)的綜合性優(yōu)勢(shì)：
  • 反應(yīng)速度極快，優(yōu)化的引物組合可以達(dá)到15min內(nèi)檢測(cè)到單copy分子，檢測(cè)速度接近或超過RPA和NASBA；
  • 能夠達(dá)到超敏檢測(cè)極限，1-5copy的分子能夠穩(wěn)定檢出，穩(wěn)定性極高，其它任何恒溫技術(shù)難以達(dá)到如此穩(wěn)定的水平；
  • 結(jié)果判讀形式的多樣化，適應(yīng)各種環(huán)境和條件下的核酸快速檢測(cè)。LAMP擴(kuò)增作為終點(diǎn)判讀形式，可不借助任何其它輔助設(shè)備，裸眼觀察檢出結(jié)果�；阝}黃綠素、HNB、紅黃變色、OG橙綠變色都可以肉眼觀察結(jié)果。LAMP同樣可借助濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)濁度分析。在反應(yīng)體系中加入SYBR Green熒光染料后，可使用小型恒溫?zé)晒鈨x進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。以上這些結(jié)果判讀形式均可在野外等非標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所需設(shè)備簡(jiǎn)單、小巧、價(jià)格低廉、便于普及。除此外，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中的熒光定量PCR儀，同樣可進(jìn)行LAMP檢測(cè)，可采用SYBR Green、MB探針法或LAMP TaqMan探針法，對(duì)于經(jīng)常操作PCR檢測(cè)的人員來(lái)講，可以無(wú)縫對(duì)接、無(wú)需更換設(shè)備。
  • 對(duì)RNA病毒的漏檢率低，由于RNA病毒的突變率較高，在PCR檢測(cè)中個(gè)別突變對(duì)PCR的擴(kuò)增影響較大，容易造成病毒漏檢的假陰性。而LAMP識(shí)別靶基因8個(gè)區(qū)段，在這些識(shí)別區(qū)段中個(gè)別的突變對(duì)LAMP擴(kuò)增影響較小，不易產(chǎn)生漏檢。
  • 試劑穩(wěn)定、易于使用。同RPA、NASBA等技術(shù)相比，LAMP與PCR法都采用單一酶（或雙酶）系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，生產(chǎn)批次穩(wěn)定、反應(yīng)酶系統(tǒng)耐高溫，試劑穩(wěn)定性好。在檢測(cè)試劑中僅包含酶mix一管、引物/探針一管，使用方便，在熒光定量PCR機(jī)器上可方便的進(jìn)行高通量檢測(cè)。而RPA、NASBA等系統(tǒng)需要多個(gè)復(fù)合酶，比例嚴(yán)謹(jǐn)、試劑穩(wěn)定生產(chǎn)困難、保存運(yùn)輸條件苛刻、難以高通量應(yīng)用。
  • LAMP法對(duì)耐受雜質(zhì)能力最強(qiáng)。PCR、RPA、NASBA等擴(kuò)增體系均需要進(jìn)行核酸純化制備，在進(jìn)行粗制品的直擴(kuò)系統(tǒng)中，上樣量均較小（<10%），無(wú)法大體積上樣，雜質(zhì)對(duì)這些擴(kuò)增方法均影響較大。而LAMP法對(duì)大多數(shù)樣本的耐受性能達(dá)到20%以上，個(gè)別樣本的含量可以容忍到50%以上，如此大的上樣體積量，決定了LAMP具有更高的檢出率。
  • 擴(kuò)增反應(yīng)同步病毒滅活，由于LAMP反應(yīng)溫度在65℃的高溫條件下進(jìn)行，在病毒液直擴(kuò)中，反應(yīng)過程中即可滅活病毒，降低耗材的污染風(fēng)險(xiǎn)。
  • 高特異性，隨著LAMP用酶不斷改進(jìn)、反應(yīng)緩沖液的不斷優(yōu)化、探針技術(shù)的搭配、引物設(shè)計(jì)理念的不斷改善，LAMP的非特異性擴(kuò)增獲得質(zhì)的提升，目前在優(yōu)化的LAMP體系中，假陽(yáng)性的情況已經(jīng)得到根本改善，假陽(yáng)性比例接近甚至低于PCR方法。
  • 多重?zé)晒馓结樀膽?yīng)用。隨著Bst DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖體系的不斷改進(jìn)、LAMP TaqMan技術(shù)的發(fā)明，多重LAMP體系得以建立。這種多重的LAMP技術(shù)，達(dá)到了金標(biāo)準(zhǔn)TaqMan PCR的多靶基因、內(nèi)參質(zhì)控樣本的相同性能，符合到臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

二、建立核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái)
于2014年啟動(dòng)LAMP技術(shù)平臺(tái)的研發(fā)與搭建，基于分子工具酶研發(fā)經(jīng)驗(yàn)和蛋白質(zhì)電子重構(gòu)架技術(shù)，歷時(shí)6年時(shí)間打造出LAMP全系DNA聚合酶，包括：Bst2.0、Bst3.0、Bst4.0、Bst5.0、Bst7.0 DNA聚合酶。精心優(yōu)化的反應(yīng)體系，打造出性能卓越、高擴(kuò)增效率、高特異性的IsoAmp Mix系列試劑，便于科研和診斷試劑的開發(fā)。上百萬(wàn)次的測(cè)試，總結(jié)出更為高效的引物設(shè)計(jì)理念，為客戶提供免費(fèi)的LAMP引物設(shè)計(jì)服務(wù)。多樣化的預(yù)混顯色試劑，滿足不同檢測(cè)需求，包括：可視化變色顯色（紅黃變色、OG變色、HNB變色）、濁度法、SYBR Green熒光法、恒溫?zé)晒馓结樂?/a>、多重恒溫?zé)晒馓结樂?/a>。除了提供頂級(jí)恒溫?cái)U(kuò)增用酶和預(yù)混mix試劑外，協(xié)助客戶進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑研發(fā)。

三、 LAMP產(chǎn)品體系及應(yīng)用
1. 原料基礎(chǔ)用酶
原料酶列表（全系提供含甘油和無(wú)甘油的酶版本）
  擴(kuò)增速度 逆轉(zhuǎn)錄活性 雜質(zhì)耐受性 dUTP識(shí)別能力 應(yīng)用
Bst 2.0 ** ** ** **** DNA LAMP SDA反應(yīng)
Bst 3.0 **** *** **** ** LAMP和RT-LAMP反應(yīng)
Bst 4.0 **** ***** **** ** RT-LAMP最佳用酶
2. 不同顯色方式的優(yōu)缺點(diǎn)比較
  紅黃變色 OG變色 HNB變色 濁度法 SYBR Green 恒溫?zé)晒馓结?nbsp;
結(jié)果判讀方式 裸眼可視 裸眼可視 裸眼可視 裸眼可視
濁度儀		 恒溫?zé)晒鈨x
定量PCR儀		 恒溫?zé)晒鈨x
定量PCR儀
反應(yīng)速度 20-30min 15-20min 20-40min 25-30min 15-25min 15-30min
靈敏度 <5copy <5copy <50copy <10copy <5copy <5copy
單copy檢出率 30% 30-50% 困難 30% >50% >50%
抗雜質(zhì)能力 ★★ ★★★★★ ★★ ★★★★★ ★★★★★ ★★★★★
假陽(yáng)性控制能力 ★★★ ★★ ★ ★★★ ★★★ ★★★★★
高通量檢測(cè)能力 ★★★★ ★ ★★★ ★★★ ★★★★★ ★★★★★
易用性 ★★★★ ★★ ★ ★★★ ★★★★★ ★★★★★
3. 恒溫?cái)U(kuò)增預(yù)混Mix系列
顯色方式 檢測(cè)模板 試劑形式 推薦選用產(chǎn)品
 
可視化系列(紅黃變色)		 DNA 液體 A3824-01
     
RNA 液體 A3824-01
     
     
       
 
可視化系列(OG橙綠變色)		 DNA 液體 A3824-02+A3821
     
RNA 液體 A3824-02+A3821
     
     
       
 
可視化系列（HNB變色法）		 DNA 液體 A3802
     
       
 
濁度法		 DNA 液體 A3824-02
     
RNA 液體 A3824-02
     
     
       
 
SYBR Green熒光法		 DNA 液體 A3824-03
     
RNA 液體 A3824-03
     
     
       
       
 
恒溫?zé)晒馓结樂?/td> 		DNA/RNA 液體 定制
凍干 定制
     
       
 
多重恒溫?zé)晒馓结樂?/td> 		DNA/RNA 液體 定制
凍干 定制
     
關(guān)于LAMP核酸擴(kuò)增的技術(shù)專利與商標(biāo)：LAMP核酸擴(kuò)增技術(shù)專利由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社所擁有（專利號(hào)CN1420928A/CN1222614C）。除此外，LAMP商標(biāo)也隸屬日本榮研化學(xué)株式會(huì)社。關(guān)于LAMP的商業(yè)化核酸檢測(cè)專利和商標(biāo)授權(quán)使用，請(qǐng)聯(lián)系榮研生物科技(中國(guó))有限公司。提供的恒溫?cái)U(kuò)增原料用酶與預(yù)混Mix系列產(chǎn)品，可用于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，但并不僅限于LAMP擴(kuò)增，還可以進(jìn)行RCA (Rolling Circle Amplification)、HDA(Helicase Dependent Amplification)、 SMAP（Smart Amplification Process）、CPA(Crossing Priming Amplification)等恒溫?cái)U(kuò)增方法。


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