發(fā)布時間：2022/3/10 13:36:51 閱讀次數(shù)：1072
本期將主講有限傳代細(xì)胞，及其代次管理方法�？靵聿槭瞻桑�
如有疑惑，請在文末留言。 #常見的有限傳代細(xì)胞 有限傳代細(xì)胞屬于二倍體細(xì)胞，它的核型相對穩(wěn)定，與生物體細(xì)胞特性更加相似，其對代次要求也更高。因有限傳代細(xì)胞的分裂存在一個極限，所以在達(dá)到該極限值后，細(xì)胞將不再繼續(xù)分裂，并會導(dǎo)致衰老、死亡，不能進(jìn)行無限增殖。 常見有限傳代細(xì)胞如表1所示： 貨號 名稱 中文名稱 理論 代次 CL-0161 MRC-5 人胚肺細(xì)胞 ~60 CL-0243 WI-38 人胚肺細(xì)胞 ~60 CL-0106 HFL1 人胚肺成纖維細(xì)胞 ~60 CL-0538 IMR-90 人胚肺成纖維細(xì)胞 ~60 CL-0657 PUMC-HUVEC-T1 SV40T轉(zhuǎn)化 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ~60 CL-0056 CCD-1095Sk 人乳腺浸潤性 導(dǎo)管癌旁皮膚細(xì)胞 ~10 表1. 常見有限傳代細(xì)胞 注意： 有限傳代細(xì)胞應(yīng)在細(xì)胞理論代次前2/3使用（如MRC-5，一般40代前狀態(tài)較好）。 #為什么細(xì)胞有傳代限制 1965年，微生物學(xué)家Leonard Hayflick提出海夫利克極限，該實驗中發(fā)現(xiàn)了人體細(xì)胞分裂次數(shù)上限為“56”， 被認(rèn)為是機(jī)體衰老的原因。 1975年，Elizabeth H.Blackburn等人發(fā)現(xiàn)端粒，其由簡單的DNA高度重復(fù)序列組成，保證每條染色體的完整性，而端粒的長度反映了細(xì)胞復(fù)制史及復(fù)制潛能。 正是因為端粒限制著細(xì)胞分裂次數(shù)，所以傳代培養(yǎng)的細(xì)胞有了傳代限制。同時，對于不同物種細(xì)胞體外培養(yǎng)代次也有所不同，如表2所示。 動物 細(xì)胞群體倍增次數(shù) 龜 90~120 人 40~60 小鼠 14~28 表2. 體外培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞的平均培養(yǎng)代數(shù) 以上就是有限傳代細(xì)胞的基本信息。接下來，我們講一下它的代次管理！ #為什么要進(jìn)行代次管理 細(xì)胞狀態(tài) 有限傳代細(xì)胞會衰老，其細(xì)胞形態(tài)特征和生長速度等會發(fā)生變化。 遺傳特性 有限傳代細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增多，在傳代過程易產(chǎn)生遺傳漂變，基因/蛋白表達(dá)發(fā)生變化。 細(xì)胞庫管理 細(xì)胞庫管理屬于細(xì)胞庫分級管理標(biāo)準(zhǔn)之一，而代次管理屬于細(xì)胞庫管理內(nèi)容之一。 #代次計算 對于有限傳代細(xì)胞代次的計算，我們可以采用記錄細(xì)胞群體倍增數(shù)（PDL）的方法。 公式如下： PDL =X+3.322(log Y – log I) X為傳代前代次，I 為細(xì)胞接種前細(xì)胞數(shù)，Y 為培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)。 注意： 1. 常規(guī)培養(yǎng)時，1:2傳代代次+1，1:3傳代代次+1.5； 2. 擴(kuò)增培養(yǎng)記錄接種細(xì)胞量以及收獲細(xì)胞量，根據(jù)公式計算代次。 #細(xì)胞代次管理 細(xì)胞的代次管理，共有以下三個步驟： 細(xì)胞引進(jìn) 當(dāng)我們得到一個新的細(xì)胞，就要記錄該細(xì)胞的初始代次。 擴(kuò)增培養(yǎng) 對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)時，可以根據(jù)傳代過程記錄代次。 分級凍存 在進(jìn)行細(xì)胞凍存時，可以根據(jù)不同級別凍存庫，對細(xì)胞代次進(jìn)行控制。 注意： 1. 常規(guī)培養(yǎng)時按照1:2傳代，記錄每次傳代后代次； 2. 凍存細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計算細(xì)胞代次，最后凍存的批次進(jìn)行傳代數(shù)檢測。 #有限傳代細(xì)胞傳代測試 在進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇后，以一定密度接種至孔板培養(yǎng)，每次密度達(dá)到80%傳代，需記錄傳代次數(shù)及傳代間隔。（要求：在預(yù)計傳代次數(shù)內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，傳代時機(jī)間隔無明顯變化。） 如測試后未達(dá)到預(yù)期傳代數(shù)，可進(jìn)行細(xì)胞衰老檢測。 細(xì)胞衰老檢測方法 在進(jìn)行檢測時，我們常用到細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶檢測試劑盒。細(xì)胞在PH值為6時，β-半乳糖苷酶陽性率隨代齡增加而逐漸上調(diào)。衰老細(xì)胞/組織產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal生成藍(lán)色產(chǎn)物（如下圖所示）。
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