發(fā)布時間：2022/8/8 12:14:23 閱讀次數(shù)：509
β-葡萄糖苷酶（β-GC） 活性檢測分光法試劑盒
貨號：YX-C-B613
規(guī)格：50T/24S
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
β-葡萄糖苷酶（β-GC） 活性檢測分光法試劑盒
試劑一：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 10mL 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 80mL×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支，5μmol/mL 的對硝基苯酚溶液。
β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化β-糖苷鍵水解，具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC負(fù)責(zé)進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖； β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味；β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放 HCN，從而防止昆蟲取食。
β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性。
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
一、樣品的前處理：
a. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 1000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測。
b. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.2g 組織，加入
1mL 提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測。
3、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取 100μL 標(biāo)準(zhǔn)液，加入到 400μL 試劑三中，得到 1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液，十倍稀釋到 100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋：50、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做標(biāo)準(zhǔn)液。
（1） 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。
（2） 加樣表
β-葡萄糖苷酶（β-GC） 活性檢測分光法試劑盒
| 試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
| 試劑一 |
| 400 |
|
| 試劑二 | 500 | 500 |
|
| 樣本 | 100 | 100 |
|
| 迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，立即放入沸水浴中煮沸 5min（蓋緊， 以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變） | |||
| 試劑一 | 400 |
|
|
| 充分混勻，8000g，4℃，離心 5min，取上清液 | |||
| 上清液 | 500 | 500 |
|
| 標(biāo)準(zhǔn)液 |
|
| 500 |
| 試劑三 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 充分混勻，室溫靜置 2min 后，400nm 處測定吸光值 A，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。 | |||
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（減去濃度為 0 標(biāo)準(zhǔn)管的 OD 值，x），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA（x）帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：
單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積， 0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品鮮重，g；1000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，1000 萬；T： 反應(yīng)時間，0.5h。
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