ALPCO-瘦素（小鼠/大鼠）ELISA是一種酶免疫測(cè)定試劑盒，適用于定量測(cè)定小鼠和大鼠血清或血漿中的瘦素，用于科學(xué)目的。僅供研究使用。不用于診斷程序。

瘦素（小鼠/大鼠）ELISA（ALP-22-LEPMS-E01）檢測(cè)原理：

瘦素（小鼠/大鼠）ELISA是一種所謂的夾心法。它利用兩種不同的特異性高親和力多克隆抗體來治療這種蛋白質(zhì)。樣本中的瘦素與固定化抗體定量結(jié)合。在接下來的步驟中，生物素化抗體又與瘦素結(jié)合。洗滌后，加入鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶偶聯(lián)物，其對(duì)生物素具有高度特異性，并與抗體的生物素結(jié)合。隨后，過氧化物酶催化酶反應(yīng)，導(dǎo)致藍(lán)色。藍(lán)色的強(qiáng)度取決于樣品的瘦素含量。通過加入終止溶液來終止反應(yīng)，并通過測(cè)量吸收來量化顏色強(qiáng)度。

樣本類型

適用于本檢測(cè)的小鼠和大鼠血清以及肝素、EDTA或檸檬酸鹽血漿是合適的樣本類型。必須考慮抗凝劑可能導(dǎo)致的樣本稀釋。

樣本收集

應(yīng)避免溶血樣本。

所需樣本體積

根據(jù)樣本的瘦素值，每個(gè)測(cè)試的最大樣本體積為50微升。樣本應(yīng)根據(jù)預(yù)期值在使用前用稀釋緩沖液（VP）進(jìn)行稀釋。

樣本穩(wěn)定性

未稀釋的血清樣本可在-20°C下冷凍保存，不會(huì)導(dǎo)致小鼠/大鼠瘦素的損失。盡管經(jīng)過幾次凍融循環(huán)后發(fā)現(xiàn)水平不受影響，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。稀釋后的樣本最多穩(wěn)定2小時(shí)。

樣本稀釋

通常，1:5至1:20的樣本稀釋是合適的。根據(jù)物種、飼養(yǎng)和/或個(gè)別實(shí)驗(yàn)條件，這可能會(huì)有所不同。如果預(yù)期瘦素濃度非常低，可以使用1:2稀釋的樣本（甚至未稀釋的樣本）。然而，如果樣本體積有限且瘦素濃度足夠，可能需要更高倍數(shù)的稀釋。

1使用稀釋緩沖液VP進(jìn)行1:5稀釋。例如，對(duì)于一個(gè)雙重測(cè)定，向PE/PP管中移液200微升稀釋緩沖液VP（推薦使用多步移液管處理大量樣本）；然后加入50微升樣本（稀釋1:5）�；旌虾�，在檢測(cè)中使用2 x 100微升的該稀釋液。

2或者，向孔中移液80微升稀釋緩沖液VP并加入20微升樣本（混合均勻）。根據(jù)預(yù)期的瘦素值，可以使用稀釋緩沖液VP進(jìn)一步稀釋樣本。

瘦素（小鼠/大鼠）ELISA檢測(cè)程序

在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，空白對(duì)照、A-G標(biāo)準(zhǔn)品、KS對(duì)照品以及樣本應(yīng)盡可能快速地移液（例如，<15分鐘）。為避免由于孵育時(shí)間差異導(dǎo)致的扭曲，抗體結(jié)合物AK、酶結(jié)合物EK以及隨后的底物溶液S應(yīng)以與樣本相同的順序和時(shí)間間隔加入到板中。停止液SL應(yīng)以與底物溶液相同的順序加入到板中。所有測(cè)定（空白對(duì)照、A-G標(biāo)準(zhǔn)品、KS對(duì)照品和樣本）應(yīng)以雙份進(jìn)行。為獲得最佳結(jié)果，建議精確移液并嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線示例：

以下數(shù)據(jù)僅供展示，不能替代在檢測(cè)時(shí)生成的數(shù)據(jù)。

圖1：標(biāo)準(zhǔn)曲線示例

圖1中顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例不能用于計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。每次進(jìn)行檢測(cè)時(shí)都必須建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

瘦素（小鼠/大鼠）ELISA檢測(cè)性能特點(diǎn)：

Leptin Mouse/Rat ELISA 使用兩種高親和力的多克隆抗體，這些抗體能夠識(shí)別小鼠瘦素。標(biāo)準(zhǔn)品是由重組小鼠瘦素制備的。對(duì)大鼠瘦素的一定程度的交叉反應(yīng)允許該試劑盒用于測(cè)量大鼠瘦素。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠樣本的稀釋與小鼠樣本一樣呈線性。來自同一生產(chǎn)商的重組小鼠和大鼠瘦素的制備在該試劑盒的定量上進(jìn)行了比較。基于生產(chǎn)商的名義聲明，大鼠材料的相對(duì)效力被發(fā)現(xiàn)大約是小鼠材料的25%。使用大鼠樣本工作時(shí)，建議用戶對(duì)試劑盒的值進(jìn)行校準(zhǔn)。這種ELISA是參照WHO NIBSC小鼠瘦素標(biāo)準(zhǔn)97/626進(jìn)行校準(zhǔn)的（見上文）。與人類瘦素的交叉反應(yīng)率為0.7%。

瘦素（小鼠/大鼠）ELISA文獻(xiàn)參考：

1. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. 1994 Positional cloning of themouse obese gene and its human homologue. Nature. 372:425-432.

2. Halaas JL, Gajiwala KS, Maffei M, et al. 1995 Weight-reducing effects of the plasma protein encodedby the obese gene. Science. 269:543-546.

3. MacDougald OA, Hwang CS, Fan H, Lane MD. 1995 Regulated expression of the obese geneproduct (leptin) in white adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9034-9037.

4. Rentsch J, Chiesi M. 1996 Regulation of ob gene mRNA levels in cultured adipocytes. FEBS Lett.379:55-59