永生化小鼠胸腺上皮細胞的鑒定及功能研究

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文章摘要

胸腺上皮細胞（TEC）作為胸腺內(nèi)三維支架中的關(guān)鍵細胞，通過粘連性內(nèi)切和各種細胞因子的釋放，在T細胞前體的歸巢，遷移和分化中起著關(guān)鍵作用。在這項研究中，分離小鼠TEC的原代培養(yǎng)物，并用TEC-specific抗體CK5和CK8進行鑒定。這些TEC通過猿猴病毒（SV）40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而永生化。然后，我們比較了TEC和永生化TEC（iTEC）的功能。通過倒置顯微鏡攝影和傳代后結(jié)晶紫測定法觀察了TECs和iTEC的細胞形態(tài)和增殖能力。然后進行軟瓊脂測定以觀察其克隆形成能力。采用IF和qPCR檢測IL-7、Lptin、Pax-9、Sema3A等上皮細胞相關(guān)因子的表達水平。將TEC與人急性單核細胞白血病細胞（THP-1）共培養(yǎng)，并用flow細胞術(shù)和CFSE標(biāo)記觀察TECs對促進THP-1增殖的影響。測量衰老相關(guān)的b-半乳糖酶-dase測定以檢測細胞的抗衰老能力。通過碘化丙啶（PI）染色分析細胞周期分布，通過膜聯(lián)蛋白V-PI染色檢測d紫杉醇（PTX）誘導(dǎo)的細胞凋亡，以評價細胞的抗凋亡能力�？v觀本文，我們發(fā)現(xiàn)永生化的TEC仍然保留了原代TEC的特征，如形態(tài)、功能和上皮特征;然而，iTEC在增殖和抗衰老方面具有更強的能力。研究表明，iTEC被SV40大T抗原成功永生化，iTEC的生物學(xué)特征和功能與原始TEC相似。這種永生化細胞可用作胸腺功能研究的應(yīng)急細胞模型，用iTEC替代原代TEC。

研究背景

作為T細胞發(fā)育的主要器官，胸腺在產(chǎn)生具有自身耐受適應(yīng)性免疫功能的成熟T細胞中起著關(guān)鍵作用。T細胞能夠識別自身主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，并在胸腺中進行負選擇后能夠區(qū)分自身抗原和非自身抗原。

胸腺由兩個功能區(qū)室組成，即髓質(zhì)和皮層。TEC是兩個隔間中的關(guān)鍵單元。TECs和發(fā)育中的胸腺細胞之間的相互作用是復(fù)雜的三維上皮細胞網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的關(guān)鍵過程，也是胸腺細胞在兩個胸腺區(qū)室正常發(fā)育中的分化和成熟的關(guān)鍵過程。在此期間，TECs分泌的因子起著關(guān)鍵作用。對胸腺生物學(xué)認識的最新進展表明，TECs的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)以及胸腺細胞和上皮細胞之間的相互作用對于維持正常的胸腺功能至關(guān)重要。人類T細胞發(fā)育的研究需要強大的模型系統(tǒng)來概括胸腺生成的整個跨度。因此，大量研究致力于構(gòu)建三維細胞模型或人工胸腺類器官(ATO)系統(tǒng)，用于研究胸腺中人類T細胞從造血干細胞和祖細胞(HSPC)中的選擇和成熟。通過成熟的T細胞。

然而，由于缺乏公認的TEC細胞系，這些系統(tǒng)顯示出很高的實驗變異性。培養(yǎng)的原代TECs的體外復(fù)制壽命有限，限制了在細胞水平上對胸腺功能的研究。缺乏穩(wěn)定和公認的胸腺細胞模型嚴(yán)重限制了在細胞水平上對胸腺細胞和TECs之間相互作用的研究。因此，延伸一條永生化TECs（iTECs）線是非常有意義的。

SV40T是一種病毒蛋白，可促進端粒酶的活化并介導(dǎo)生長抑制劑的失活[6]。多項研究表明，將SV40T病毒轉(zhuǎn)染到細胞中可以使不同類型的細胞類型永生化，例如犬附睪細胞系[7]、人肝星狀細胞系[8]和豬結(jié)腸上皮細胞系[9]。本研究的目的是利用SV40T病毒建立iTEC模型，并觀察細胞特性和功能的變化[10]。它有助于為研究人類T細胞發(fā)育和基于干細胞的體外工程T細胞療法方法提供穩(wěn)定的工具。

研究內(nèi)容

1．iTECs表達上皮細胞特異性標(biāo)志物CK5和CK8

通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將異源基因SV40T轉(zhuǎn)移到TECs中。用4mg/mL潮霉素篩選后，體外培養(yǎng)陽性細胞。觀察到的細胞狀態(tài)良好，形態(tài)穩(wěn)定。PCR結(jié)果顯示，iTECs組在500bp左右有一條亮帶，與預(yù)期的目標(biāo)片段位置476bp和TECs中未顯示的目標(biāo)帶一致（圖1A）。結(jié)果表明，外源基因SV40T已成功整合到TECs基因組中。TECs和iTECs的免疫熒光染色顯示它們均表達上皮細胞特異性標(biāo)志物CK5和CK8。TECs和iTECs的典型細胞質(zhì)和核染色結(jié)果如圖2A所示。表明分離的細胞確實是胸腺上皮細胞，成功地永生化，并保留了原代TECs的上皮特性。

2.iTECs表現(xiàn)出高增殖和克隆形成活性

結(jié)晶紫實驗表明TECs和iTECs組的細胞數(shù)量在傳代后d1時是相同的。傳代到d4后，iTEC組的細胞明顯增多，這意味著iTECs的增殖率明顯高于TECs（圖1C）。此外，兩種細胞的細胞形態(tài)也不同：TECs呈規(guī)則的橢圓形，細胞觸角短，生長集中致密，而iTECs呈明顯的梭形，細胞分散且獨立生長（圖1）。1D)。結(jié)果類似于Toouli等人的結(jié)果[17]。軟瓊脂上的集落形成結(jié)果表明TECs和iTECs都可以形成細胞集落。菌落直徑

iTEC中200mm占iTEC組總菌落的59.52±14.14%，而TEC組僅占11.67±3.50%（圖1B）。細胞周期結(jié)果顯示，TECs中G0/G1、G2/M和S細胞的比例分別為36.83±1.96%、18.43±5.81%和45.44±5.63%，而各時期iTECs的比例為27.99±2.52%和16.11±6.34%、54.40±8.0%（圖3A）。結(jié)果表明，永生化后TECs的形態(tài)發(fā)生了變化。iTECs的細胞增殖和克隆形成能力高于TECs。

3.iTECs更能耐受DNA損傷和老化

為了評估TECs和iTECs對DNA損傷的反應(yīng)是否不同，每個細胞系都暴露于DNA嵌入劑PTX。ANNIXIN-V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，TECs-Control組、TECs-PTX組、iTECs-Control組和iTECs-PTX組細胞凋亡率分別為16.70±3.70%、22.34±4.21%、9.92±2.79%和16.50±3.65%（圖3B）。值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。結(jié)果表明iTECs對PTX誘導(dǎo)的DNA損傷更耐受。細胞衰老是機體抑制腫瘤的一種機制，也是衰老的原因之一。老化細胞表現(xiàn)出與衰老相關(guān)的b-半乳糖苷酶(SA-b-半乳糖苷酶)染色呈綠色陽性，并顯示扁平細胞形態(tài)[18]。結(jié)果表明，當(dāng)TECs和iTECs都在第3位時

傳代后，TECs和iTECs中陽性細胞（衰老細胞）的比例分別為5.49%和5.81%（圖3Ca和3Cc）。當(dāng)TECs傳到第6代時，陽性細胞率為45.04%。相比之下，iTECs在第12代時，陽性細胞數(shù)明顯減少，細胞形態(tài)呈扁平狀（圖3Cb和3Cd）。結(jié)果表明，與TECs相比，iTECs具有更快的分裂增殖能力和更強的抗衰老能力。

4.iTECs表達TEC標(biāo)記和相關(guān)因子

我們?nèi)�面檢測了TECs增殖、分化和激活過程中關(guān)鍵因子的表達水平，包括TNF-a、IL-1b、IL-7、Sema-3A、Leptin、ACTH、FGFR2IIIb、Foxn1及其下游基因Pax9.半定量RT-PCR（qPCR）結(jié)果顯示TECs和iTECs分泌的上述細胞因子的表達水平相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B）。結(jié)果證實，永生化后胸腺上皮細胞的上皮功能沒有明顯變化。

5.iTECs和TECs對THP-1增殖表現(xiàn)出相似的促進作用

CFSE染色的THP-1細胞與TECs或iTECs共培養(yǎng)48h，流式細胞儀檢測THP-1細胞增殖情況。結(jié)果顯示，對照組、TECs組和iTECs組THP-1在親本組中的比例分別為66.09±3.55%、54.51±7.18%和53.25±7.39%。與Control組相比，TEC組和iTEC組母體細胞比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）；然而，TEC組和iTEC組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A）。

圖1.(A)PCRAssay的凝膠電泳檢測TECs和iTECs中的SV40T。M：600bp梯形圖，TECs(1)和iTECs(2)的GAPDH，3：TECs(3)和iTECs(4)的SV40T。(B)TECs和iTECs在軟瓊脂中的菌落生長能力。(C)結(jié)晶紫染色法測定細胞活力和增殖。細胞在所描述的指定時間點用結(jié)晶紫染色。(D)相同通道的原代和永生化小鼠胸腺上皮細胞的形態(tài)學(xué)。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請讀者參考本文的網(wǎng)絡(luò)版本。）

圖2.(A)iTECs表達與TECs相同的上皮細胞特異性標(biāo)志物。DAPI（藍色）、CK5（紅色）和CK8（綠色）以及TECsGroup和iTECsGroup的合并圖像；照片是在放大400倍的顯微鏡下拍攝的。(B)條形圖表示TECs和iTECs中TNF-a、IL-1b、IL-7、Sema3A、Leptin、ACTH、FGFR2IIIb、Foxn1和Pax9mRNAs的相對表達(平均值±S.E.M.)。數(shù)據(jù)來自三個獨立的實驗。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請讀者參考本文的網(wǎng)絡(luò)版本。）

圖3.(A)TECs和iTECs的細胞周期率。(B)PTX對TECs和iTECs凋亡率的影響。(C)在第3代(a)和第6代(b)的TECs組和第3代(c)和第12代(d)的iTECs組中進行衰老相關(guān)的b-gal染色。黑色箭頭指向藍色染色的細胞。。

圖4.CSFE染色用于測試TECs和iTECs對THP-1細胞增殖的影響。數(shù)據(jù)代表母細胞率(%)和平均值±SE,n=3。

結(jié)論與討論

關(guān)于胸腺功能，TECs是研究的主要細胞類型之一，因此在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究中引起了極大的關(guān)注�？赡娴�SV40T介導(dǎo)的永生化策略賦​​予TECs無限的文化壽命，對TECs的應(yīng)用具有重要意義。作為建立永生化細胞系最常用的方法，由SV40編碼的大T抗原在感染從有限組織來源分離的允許細胞導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。在我們的研究中，SV40LT-SSR69質(zhì)粒被用來感染原代TECs，因此，永生化的TECs附著在培養(yǎng)皿底部，可以連續(xù)傳遞。iTECs生長更快并保持較高的增殖率（圖1C）。事實上，iTEC到現(xiàn)在已經(jīng)傳了超過45代，并且增殖良好。iTECs的細胞形態(tài)等基本特征與TECs相似，iTECs具有上皮細胞的生長特征。IF結(jié)果顯示iTECs仍​​表達CK5和CK8，從而保留了TECs的上皮功能。

細胞周期分析、細胞凋亡分析和軟瓊脂集落形成分析結(jié)果也表明，iTECs的增殖和存活率優(yōu)于TECs。TECsS期細胞為45.44±5.63%，低于iTECs54.40±8.0%，TECsG0/G1期細胞百分比顯著高于iTECs。PTX誘導(dǎo)的正常TECs的凋亡率也高于iTECs。TECs和iTECs都可以在軟瓊脂培養(yǎng)基中生長，但無論克隆的數(shù)量或大小如何，iTECs都具有更顯著的克隆形成能力。永生化可以延長TEC在培養(yǎng)條件下的細胞壽命。我們檢測到了生物標(biāo)志物“衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶”（SA-b-gal），

這可以方便地在體外識別單個衰老細胞。β-半乳糖苷酶是一種穩(wěn)定的酶，廣泛存在于體外和體內(nèi)不同來源的衰老細胞中[19]。衰老和永生化細胞群中的半乳糖苷酶活性表明，在TECs中SA-b-gal染色細胞（細胞質(zhì)被染成綠色）的陽性百分比較高。

TECs通過分泌不同種類的細胞因子來調(diào)節(jié)T淋巴細胞的正向和負向選擇。TNF-α是一種多效性細胞因子，在胸腺中組成型表達[20]。白細胞介素(IL)-7是T淋巴細胞發(fā)育和體內(nèi)平衡所必需的細胞因子[21]，而白細胞介素1β(IL-1b)主要來源于免疫細胞[2,22]。軸突排斥因子Sema3A參與胸腺中的許多細胞過程，包括胸腺細胞的粘附和遷移[23-25]。激素因子（如瘦素，至少在一定程度上通過激素對T細胞的直接作用來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫[26,27]，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)在調(diào)節(jié)胸腺增大中起核心作用，對活化的體外人類B細胞[33,34])。Forkhead-box轉(zhuǎn)錄因子n1(Foxn1)及其下游配對盒基因9(Pax9)調(diào)節(jié)TEC分化并驅(qū)動未成熟上皮細胞分化為功能性cTECs和mTECs[28-30]。成纖維細胞生長因子受體2IIIb(FGFR2IIIb)信號傳導(dǎo)對胸腺上皮增殖至關(guān)重要[31,32]。在這項研究中，它們在TEC和iTECs中都以相同的水平表達。

總之，永生化TECs的生物學(xué)特性和功能與原始TECs的生物學(xué)特性和功能沒有顯著差異，我們的研究表明，永生化可以延長TECs的體外培養(yǎng)時間。iMHCs仍具有正常TECs的分泌功能，可促進單核細胞的增殖。本研究為研究胸腺和胸腺細胞發(fā)育和體外功能提供了另一種細胞模型。