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Exosome外泌體資料的詳細(xì)總結(jié),供分享

發(fā)布時(shí)間:2024/10/10 9:19:53      閱讀次數(shù):239

  一、Exosome簡介

       最近幾年,一種叫做Exosome的小囊泡正受到大家廣泛的關(guān)注。Exosome是直徑約為30-150nm,密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于體液中,包括血液、唾液、尿液和母乳,外泌體(Exosome) 是活細(xì)胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體 )的膜性囊泡。

       Exosome在30年前被人們所發(fā)現(xiàn)。早期的研究認(rèn)為,exosome執(zhí)行蛋白運(yùn)輸功能,特異靶定受體細(xì)胞,交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號(hào)事件。直到2007年,研究人員發(fā)現(xiàn)exosome也運(yùn)輸核酸,參與細(xì)胞間通訊?傊,其蛋白、RNA和脂肪成分特異,且攜帶了一些重要的信號(hào)分子,有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用,這使得exosome的市場也在快速擴(kuò)展,并成為熱門的研究對(duì)象。

      不同組織細(xì)胞來源exosome由于攜帶的蛋白質(zhì)不同,而能夠發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。例如,腫瘤細(xì)胞分泌的exosome能夠介導(dǎo)血管再生腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸;而樹突狀細(xì)胞源性exosome則能夠引起機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn),Exosome內(nèi)含有與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)rRNA和microRNA,并且exosome能夠通過生物屏障,在細(xì)胞間傳遞功能性核酸分子,從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能,故exosome有望成為一種新型給藥途徑及基因治療載體。

      Exosome攜帶蛋白質(zhì)包括源細(xì)胞非特異性和源細(xì)胞特異性兩類蛋白分子。前者可能與exosome的生物發(fā)生和生物學(xué)作用有關(guān) ,主要包括:細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白;另一類是特殊蛋白質(zhì),這類蛋白質(zhì)只存在于某種特殊的細(xì)胞分泌 的exosome,而這些特定細(xì)胞源的exosome與其生物學(xué)功能有著密切聯(lián)系,例如分子來源的Exosome上含有MHCII類分子。

 

二、Exosome提取

      Exosome是由活細(xì)胞分泌的,它是一種亞細(xì)胞成分,組要成分是磷脂雙分子和攜帶的膜性分子,其界定依據(jù)形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)及提取方式不同細(xì)胞源的exosome是不同的,這些不同的理化性質(zhì)有利于exosome的提取。從體外培養(yǎng)的細(xì)胞中分離和提取exosome的主要方法是高速離心法,這種方法能分離出大的碎片和已經(jīng)死亡細(xì)胞, 然后再通過超速離心法分離 提取exosome 最后利用糖梯度,使脂質(zhì)囊性質(zhì)的exosome漂浮于上面。

      具體來說,exosome的研究方式是分離/捕獲小囊泡,并拷問它所攜帶的貨物。就目前而言,人們多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾的方法,對(duì)exosome進(jìn)行前期的分離。之后利用電鏡來分析其大小和形態(tài),利用流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞表面標(biāo)記,通過Western blot和ELISA等方法對(duì)蛋白進(jìn)行分析,或通過qPCR和新一代測序(NGS)來分析RNA。

      調(diào)查發(fā)現(xiàn),在分離exosome時(shí),約有56%的人采用超速離心法,說明這種方法仍是目前的金標(biāo)準(zhǔn)方法。不過,生物通之前也介紹過,這種方法缺點(diǎn)也不少:耗時(shí)耗力,往往需要8-30個(gè)小時(shí);每次最多只能處理6個(gè)樣品;需要大量的起始材料;產(chǎn)量不高。商業(yè)化的exosome提取試劑盒已經(jīng)上市,更為簡單省事。

1.超速離心法

       將欲提取的細(xì)胞培養(yǎng)上清液10ml,在4 ℃的環(huán)境下,300×g 10min ,2000×g 20min,棄沉淀,去除細(xì)胞;然后 l0,000×g 30min ,棄沉淀,去除亞細(xì)胞成分;再用10,000×g 60min,棄掉上清液,最后所得沉淀既為exosome ,用30ml PBS 溶液重新懸浮沉淀物,混勻后再以10,000×g 60min,用 l ml PBS溶液懸浮沉淀物提純的exosome 溶液分別裝入eppendorf 管內(nèi),置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/span>

2.磁珠

      超速離心法既耗時(shí)又費(fèi)力。現(xiàn)在您可以通過使用靈活可控的總外泌小體分離試劑,從不同的起始樣本中方便地富集完整的外泌小體。這些試劑及其配套的試驗(yàn)方案完美適用于廣泛的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃,包括小輸入樣本量和多種樣本處理實(shí)驗(yàn)。

      從培養(yǎng)細(xì)胞中富集的總外泌小體(使用總外泌小體分離試劑或超速離心)可以通過免疫磁性捕獲法進(jìn)一步純化為亞組分?墒褂没贒ynabeads?的CD63特異性試劑,或?qū)㈡溍褂H和素試劑與特定的生物素化抗體結(jié)合使用,可基于表面抗原的免疫反應(yīng)純化得到任何所需的亞組分。

 

三、Exosome分析

      在下游分析方面,分離純化出來的exosome可以做蛋白,也可以做RNA(microRNA和LncRNA),36%的研究人員通過Western blot或其他方法來鑒定蛋白,29%的人員利用qPCR對(duì)microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析,9%利用芯片進(jìn)行microRNA表達(dá)譜分析。同時(shí),新一代測序的用戶也不少,13%的人員利用NGS開展microRNA/小RNA研究,9% 開展mRNA研究。此外,目前的大部分工作還是停留在科研階段,后續(xù)的生物標(biāo)志物開發(fā)和驗(yàn)證不多,而診斷和療法的開發(fā)就更少。Razvi認(rèn)為,exosome的定性和定量研究是個(gè)快速發(fā)展的市場。同時(shí),循環(huán)生物標(biāo)志物的市場也存在著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。不過,無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)的成功讓人們相信,循環(huán)生物標(biāo)志物有望在腫瘤及其他疾病的診斷上發(fā)揮作用。

1.蛋白分析

1)SDS-PAGE

通過SDS-PAGE電泳可以分析得到的Exosome中蛋白的含量及種類。

2)Western-Blot

通過Western-Blot可以檢測Exosome中特定的蛋白表達(dá)情況。

3)2-DE等蛋白組學(xué)分析

可以了解Exosome中不同蛋白的表達(dá)、數(shù)量情況

2. 透射電鏡

通過透射電鏡可以分析Exosome的大小、形態(tài)等,再結(jié)合免疫標(biāo)記可以很清楚的分析特定指標(biāo)在Exosome表達(dá)的部位。

3.基因水平

1)Real-Time PCR

通過PCR可以分析需要研究的指標(biāo)的表達(dá)量

2)轉(zhuǎn)錄組分析

通過測序或者芯片,分析Exosome不同基因的轉(zhuǎn)錄水平

3)miRNA 

通過測序或者芯片,檢測與Exosome相關(guān)的miRNA的表達(dá)情況,研究特定的miRNA

4)lncRNA分析

通過測序或者芯片,檢測與Exosome相關(guān)的lncRNA的表達(dá)情況,研究特定的lncRNA與Exosome共同調(diào)控某種疾病的關(guān)系

 

四、Exosome中RNA的分離

1.切體隔離

增長切體無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞。因此,任何血清細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的外來應(yīng)耗盡120萬個(gè)晚上XG離心在4 ° C后才能使用。

將細(xì)胞懸液錐形管。

4 ° C沉淀細(xì)胞,離心10分鐘300 XG。

轉(zhuǎn)移上清超速離心機(jī)管,如果不徹底全面加入PBS。

樣品16 500 XG離心20分鐘,4 ° C至進(jìn)一步去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。

通過0.2微米過濾除去大于200納米的顆粒過濾上清液。

過濾上清液轉(zhuǎn)移到新的超速離心機(jī)管和120 000 XG 70分鐘前,超速離心機(jī)密封管在4 ° C至顆粒的外來體。

棄上清。

最大的外切體檢索,懸浮切體充實(shí)ED顆粒多次在一個(gè)適當(dāng)?shù)木彌_體積。?3 × 50μL)。這個(gè)緩沖區(qū)取決于以下的切體隔離計(jì)劃的下游實(shí)驗(yàn)。例如,裂解液用于蛋白質(zhì)和RNA的分離,PBS是用于電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀和功能的研究介質(zhì)可能是首選。

;外來體也可以從不同的體液,如血漿,使用相同的過程,作為細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。對(duì)于粘性液體,它可能是必要的,用PBS稀釋的樣品離心和過濾步驟之前的。在上述5點(diǎn)的離心速度,它可以增加至29 500 XG,第7點(diǎn)中的離心可以延長至90分鐘18。

如果樣品需要進(jìn)一步純化的外切體顆粒可漂浮在蔗糖梯度和外來將主要分?jǐn)?shù)representing一個(gè)密度1.13-1.19克/毫升2。


2.切體識(shí)別電子顯微鏡

為了進(jìn)一步消除污染蛋白,重懸在120 000 XG 70分鐘,在4 ° C至重新沉淀外來的外切體的豐富沉淀,PBS和超速離心機(jī)。

的蛋白分離和總蛋白測定樣品的小等分。確保只有一小部分樣品裂解和蛋白質(zhì)測量,并保存完整的外來體,解決的PBS,單獨(dú)的冰或在-80℃為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

將在PBS重懸的完整的外來exosomal蛋白質(zhì)約10微克,一個(gè)下降,一個(gè)封口膜。然后,用血管鉗,輕輕的位置上每一滴30-60分鐘的頂部formvar碳包覆鎳網(wǎng)格。保證網(wǎng)格定位涂層的一面面臨下降含外來。

將三滴,每30μL的PBS,在T他封口膜和洗網(wǎng)格,按順序定位的PBS液滴上的電網(wǎng)和使用吸油紙之間。使用吸油紙輕輕只是抱著它不涂面積接觸,密切合作,以電網(wǎng)側(cè)。

修復(fù)存款樣品的封口膜下降了2%多聚甲醛,并放置在頂部的10分鐘下降的網(wǎng)格。

重復(fù)洗滌步驟中的第4點(diǎn),前一個(gè)合適的抗體免疫。常用的抗體是抗CD63和抗MHCⅡ類。電子顯微鏡也可以不免疫作為外來體的大小和形態(tài)上,完全可以識(shí)別基于。但是,我們建議,評(píng)估的大小,形態(tài)和為一個(gè)更確鑿的驗(yàn)證的膜蛋白的存在。

網(wǎng)格傳輸選擇的主要抗體30μL下降,孵育40分鐘。洗凈重復(fù)第4點(diǎn),但在PB中使用0.1%的牛血清白蛋白S代替的PBS單獨(dú)。

重復(fù)第7點(diǎn),但與10納米金標(biāo)記的第二抗體和單用PBS洗。

修復(fù)后下降了2.5%戊二醛中加入的封口膜樣品,孵育10分鐘下降頂部的網(wǎng)格。重復(fù)第4點(diǎn)的洗,但使用去離子水液滴,而不是三個(gè)水滴的PBS。

對(duì)比樣品加入下降2%醋酸鈾的封口膜,下降為15分鐘的頂部,并培育網(wǎng)格。

嵌入下降了0.13%甲基纖維素和0.4%的醋酸鈾的封口膜樣品,孵育10分鐘下降頂部的網(wǎng)格。

刪除多余的液體,然后輕輕地使用吸油紙的定位與涂邊格在一張紙上,讓空氣干燥5分鐘。

用電子顯微鏡檢查的籌備工作,或存儲(chǔ)在網(wǎng)格中的電網(wǎng),為今后的工作。


3.由流式細(xì)胞儀的外切體的表征

作為外來太小,由目前的流式細(xì)胞儀設(shè)備檢測,有必要先綁定外來抗體包被的磁珠( 1) 。這些珠子可以購買一個(gè)現(xiàn)成的產(chǎn)品,或選擇的抗體在實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)exosomal細(xì)胞來源,不同的抗體可以配上珠可以磁或乳膠字符。我們目前使用的抗MHC II類或抗CD63的包被的磁珠這種分析。

對(duì)于使用“國產(chǎn)”的抗體包被的磁珠,我們使用4微米乳膠具有抗CD63抗體包被的磁珠。 25μL4微米乳膠珠(30 × 10 6珠)100μL的MES緩沖的兩倍,3 000 XG 15-20分鐘,洗凈,在100μL的MES緩沖溶解沉淀。準(zhǔn)備抗體的混合物,其中包含一個(gè)體積等于12.5微克抗體與相同體積的MES緩沖。添加珠抗體的混合物,在室溫下孵育過夜攪拌?贵w包被的磁珠洗凈,用PBS(3 000 20分鐘XG)三次沉淀溶于100μL存儲(chǔ)緩沖區(qū)(與終濃度為300 000珠/μL)。

對(duì)于每個(gè)樣本(每個(gè)抗體),繼續(xù)與卷等于30微克exosomal蛋白質(zhì)的最低%?100 000抗體包被珠(PBS中解決了完整的外來)。

孵育外來珠,在一個(gè)總體積300μLPBS過夜,在4 ° C下輕柔的動(dòng)作。

加入300μL200毫米甘氨酸和孵化30分鐘座。

兩次洗滌緩沖液的切體珠復(fù)合物(1-3%血清的PBS),10分鐘600 XG洗凈。

孵育50μLIgG抗體的外切體珠復(fù)合物4 ° C。在洗滌緩沖液洗凈切體珠復(fù)合物,在第5步中所述的兩倍。

添加90μL洗滌緩沖液和10μL抗體的選擇(理想的抗CD9,抗CD63或CD81的反)的切體珠復(fù)合物和40分鐘,輕柔的動(dòng)作下孵育。在洗滌緩沖液的切體珠復(fù)合物在第5步中所述的兩次洗凈。

加入300μl洗滌緩沖液,并用流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)。

如上所述,不同的珠子可以使用,如協(xié)議或磁珠所述的乳膠珠。如果用來代替磁珠,請(qǐng)注意,該協(xié)議是略有不同。阻塞步驟(4點(diǎn))是不是必需的,是由放置在一個(gè)磁性的立場,而不是一個(gè)離心管進(jìn)行洗。

“自制”的抗體包被的磁珠使用的存儲(chǔ)緩沖區(qū),包含0.1%甘氨酸和azid在PBS,pH值7.2,0.1%鈉。

更重要的是,確保使用流式細(xì)胞儀洗滌緩沖液(1-3%血清的PBS)外切體耗盡血清,以避免任何血清外來污染分析。

請(qǐng)注意,使用抗體加上珠的切體的表征時(shí),重要的是要承認(rèn),這僅僅是一個(gè)特定的亞群,特定于所使用的抗體,即分離并鑒定。


4.切體檢測用Western blot

Western印跡是一個(gè)行之有效的方法,我們不會(huì)細(xì)講就方法本身,但重點(diǎn)放在一個(gè)合適的蛋白分離前的印跡和使用不同的抗體的重要性。

溶解蛋白裂解液的選擇外切體顆粒,并徹底吹打,旋渦混合。要進(jìn)一步裂解的外來體,超聲水浴中3 × 5分鐘之間的旋渦混合樣品。最后,在室溫下5分鐘離心樣品13 000 XG,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的Eppendorf管。

Measu重新選擇的方法總蛋白和負(fù)載20-50微克的蛋白質(zhì),每口井。

凝膠電泳和電泳分離和轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。

座和洗膜,然后再執(zhí)行對(duì)在外來豐富的蛋白質(zhì)免疫。

檢測化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)和分析軟件的特定蛋白質(zhì)。

至于有沒有切體的特異性標(biāo)志物,在外來豐富的蛋白質(zhì),從各個(gè)不同的細(xì)胞起源,是常用的外切體檢測。這些tetraspanins(如CD9,CD63和CD81),細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(如ezrin)和多泡的生物合成(如TSG101和ALIX)涉及的蛋白質(zhì),如蛋白質(zhì)。其他蛋白質(zhì)也常用于外來檢測Flotillin,HSC70和不同的Rab蛋白等,但也有特定的蛋白質(zhì),如A33(腸上皮細(xì)胞)的外來細(xì)胞中CD3(T細(xì)胞)和MHCⅡ類(抗原呈遞細(xì)胞)。因此,根據(jù)外來體是由什么類型的細(xì)胞進(jìn)行檢測標(biāo)記發(fā)布可能會(huì)有所不同。

由于其他車廂的細(xì)胞也能產(chǎn)生水泡,這是進(jìn)一步建議,以確定這些車廂,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(如calnexin和GRP78)和高爾基體(如GM130)的蛋白質(zhì)的存在。因此,這些蛋白質(zhì)的缺乏表示沒有或很少污染樣品中的其他車廂的囊泡研究。

 

5. exosomal RNA和RNA分析的分離

切體顆粒溶解在RNA裂解液的選擇和執(zhí)行RNA的提取。根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)不同的RNA分離試劑盒可用于,但基于列的方法提供了更廣泛的RNA樣品。目前,我們正在使用由Exiqon miRCURY RNA分離試劑盒,但可能適合在SC上其他套件ientific問題就在眼前。

在進(jìn)行RNA的分離是很重要的工作在無RNase的環(huán)境。因此,使用核酸和核酸免費(fèi)槍頭和擦拭工作臺(tái)和設(shè)備,無污染物和核糖核酸酶。

RNA的提取,使用miRCURY RNA提取試劑盒,溶于350μL裂解液的切體顆粒,并執(zhí)行旋渦混合15秒。

加入200μl95%乙醇和10秒的旋渦混合的。

放置在一個(gè)收集管一列,并轉(zhuǎn)移裂解外來列和離心1分鐘14 000 X G.

包含exosomal RNA和離心1分鐘14 000 X G.列加入400μL洗滌液洗三次

離心2分鐘14 000 XG,以確保該列是干的,并放置在一個(gè)無RNase Eppendorf管干欄列。

加入50μL洗脫液列和2型離心機(jī) 200 XG分鐘,其次是1分鐘14 000 X G.

繼續(xù)分離出的RNA,或存放在-80 ° C。

 


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