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發(fā)布時(shí)間：2024/11/20 10:00:47 閱讀次數(shù)：119
一：實(shí)驗(yàn)原理
MSC首先收回其突起，聚集成團(tuán)這個(gè)團(tuán)中間的細(xì)胞經(jīng)分裂分化轉(zhuǎn)變成一種大而圓的細(xì)胞即成軟骨細(xì)胞成軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)和纖維（主要為II型膠原蛋白），當(dāng)基質(zhì)的量增加到一定程度時(shí)成軟骨細(xì)胞被分隔在陷窩內(nèi)分化為成熟的軟骨細(xì)胞，體外誘導(dǎo)成軟骨分化的鑒定主要圍繞成軟骨的標(biāo)志物II型膠原蛋白來進(jìn)行
二：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
提前準(zhǔn)備好將要用到的試劑：細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清、阿利新藍(lán)染色液、核固紅染色液、間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化添加物A、間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化添加物B。
配置前6h將優(yōu)級(jí)胎牛血清放置于4℃冰箱內(nèi)完全融化，提前30min將成軟骨誘導(dǎo)分化添加物AB都放置于4℃冰箱內(nèi)將準(zhǔn)備好的試劑移入超凈臺(tái)中上下顛倒或輕彈試劑管以混勻試劑，先將優(yōu)級(jí)胎牛血清加入細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中再將成軟骨誘導(dǎo)分化添加物也加入細(xì)胞培養(yǎng)基中取少量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，洗滌各瓶、管盡可能將所有成分全部加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基搖晃混合均勻用封口膜密封瓶口用鋁箔紙包裹瓶身再次用封口膜加固包裝并標(biāo)注名稱、配制日期等信息。
三：誘導(dǎo)操作
將準(zhǔn)備好的裝有細(xì)胞的T75瓶從培養(yǎng)箱中取出，顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，吸去上清加入胰蛋白酶消化液至T75瓶中，搖晃均勻置于培養(yǎng)箱中消化3min消化完成后加入含血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打混勻加入離心管中進(jìn)行離心準(zhǔn)備1000轉(zhuǎn)離心5min棄去上清加入無血清培養(yǎng)基重懸吹打混勻，提取一些細(xì)胞溶液加入臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，往六孔板中加入每孔2 mL普通完全培養(yǎng)基將細(xì)胞按照2x104cells/cm4的細(xì)胞密度接種手六孔板中細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)于細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，將六孔板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天換用新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基首先吸棄舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基
注意：需待培養(yǎng)基回復(fù)室溫，緩慢滴加，誘導(dǎo)2~4周后視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長情況用阿利辛藍(lán)進(jìn)行染色。
四：染色分析
吸棄孔內(nèi)成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔洗滌2~3次吸棄孔內(nèi)多余緩沖液每孔加入2mL的4%多聚甲醛溶液（或10%福爾馬林）固定10min以上，吸去固定液，加入PBS輕柔洗滌2~3次確保將固定液清洗徹底，吸棄多余固定液孔內(nèi)加入1%阿利新藍(lán)染色液（pH2.54）室溫染色30min，吸阿利新藍(lán)染色液，向里面加入PBS緩沖液，輕柔洗滌2~3次充分洗去染色液，吸棄多余液體加入0.1%核固紅染色液室溫染色5~10min，吸棄孔內(nèi)染色液使用流水沖洗，吸棄多余液體家兔去離子水浸泡置于顯微鏡下觀察染色效果。
細(xì)胞鑒定
軟骨的破壞、缺失是包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種骨科疾病的重要病理改變，由于軟骨特殊的解剖及組織特性如缺乏血和淋巴管的分布使得其自我修復(fù)能力異常不足，因此通過人工的方法修復(fù)軟骨破壞具有重要臨床意義，近年來隨著間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究深入其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在軟骨修復(fù)應(yīng)用中具有令人期待的潛力。體外誘導(dǎo)軟骨分化鑒定，主要圍繞成軟骨的標(biāo)志物——II型膠原蛋白來進(jìn)行，而甲苯胺藍(lán)則主要檢測(cè)成軟骨細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖。
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