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發(fā)布時(shí)間:2024/11/20 10:02:31 閱讀次數(shù):124
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定教程
一:細(xì)胞簡(jiǎn)介
小鼠胚胎成年維細(xì)胞常用作ES細(xì)胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞,能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞自主分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子,故能有效地促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖井維持其示分化特性和多潛能性,且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子而且可以為ES細(xì)胞的培養(yǎng)提供類似于體內(nèi)的微環(huán)境故在研究哺彩L動(dòng)物ES細(xì)胞中得到廣泛使用。
二:實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
提前準(zhǔn)備好將要用到的工具、試劑:無(wú)菌槍頭、無(wú)菌EP管、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基、胚胎成纖維細(xì)胞組織分離液、胚胎成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、HBSS緩沖液。
三:實(shí)驗(yàn)步驟
取孕13.5天小鼠,斷頸處死,置于體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒3 min無(wú)菌打開(kāi)孕鼠腹腔可見(jiàn)腹腔兩側(cè)呈“V”字型串珠樣子宮。用鑷子提起子宮(注意:不能碰到皮毛,以防污雜)并用眼科剪去除子宮系膜和結(jié)締組織,將子宮放入含有HBSS的一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中漂洗兩三遍去除淤血,用眼科剪和鑷子去除胎盤、手膜等胚胎外組織,取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗滌,直到?jīng)]有血跡為止。用眼科剪和鑷子去除胚胎的頭部、四肢及內(nèi)臟,留取軀干部(頭部、四肢及內(nèi)臟需去除干凈)將軀干部放入玻璃平皿中用HBSS洗滌1次,用眼科剪將胚胎軀干部剪碎成糊狀加入5mL HBSS混勿移入離心管中,自然沉降3min后將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下自然沉降2min,將上清液輕輕吸出棄掉加入3mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下消化3min,將上部的單細(xì)胞懸液輕輕吸出放入另一個(gè)離心管中加等量小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化,重復(fù)消化兩次若還有未消化的組織再加入2 mL組織分離液輕輕吹打至完全消化。終止消化,混勻離心管收集所有細(xì)胞懸液自然沉降1min,將大塊沉淀吸出棄掉800轉(zhuǎn)每分鐘離心5mi棄去上清,使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸至5 mL吸取細(xì)胞溶液,加入臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行計(jì)數(shù)按5x106/瓶接種到T25培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基記為原代(PO)搖晃混勻,在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后換液。
細(xì)胞鑒定
24h后可見(jiàn)絕大部分貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞體積較小,雜細(xì)胞較少,30min細(xì)胞貼壁,其中部分開(kāi)始伸出偽足,表現(xiàn)為小的突起,6h后細(xì)胞基本貼壁完全,伸展成梭形,胞核清晰,分布較均勻,散在生長(zhǎng),不聚集成團(tuán);分布較均勻,散在生長(zhǎng),不聚集成團(tuán),細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,5-7天即呈融合狀態(tài),細(xì)胞排列緊密,有的交叉重疊生長(zhǎng),平坦、胞體較大,細(xì)胞質(zhì)透明,細(xì)胞核較大,呈橢圓形,顏色淡,細(xì)胞融合,并彼此連接成網(wǎng)狀,細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定純度可達(dá)90%以上
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