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原代細胞大鼠甲狀旁腺細胞的分離培養(yǎng)

發(fā)布時間：2024/11/29 9:50:09 閱讀次數(shù)：89

甲狀旁腺是哺乳動物體內(nèi)分泌腺之一，有兩對，棕黃色，分別位于左右兩葉甲狀腺背面的中部和下部，其主要功能為分泌甲狀旁腺激素，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷的代謝。甲狀旁腺功能減退癥是指甲狀旁腺激素分泌減少或功能障礙的一種臨床綜合癥。

甲狀旁腺細胞來源于實驗動物的正常甲狀旁腺組織，形態(tài)多為梭形，多角形細胞，貼壁培養(yǎng)生長，通過PTH免疫熒光染色鑒定為陽性，細胞的純度高于90%，不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

甲狀旁腺細胞分離培養(yǎng)試驗所需儀器設(shè)備及試劑

（1）儀器

儀器名稱

生物安全柜

CO2細胞培養(yǎng)箱

熒光倒置顯微鏡

高速冷凍離心機

電熱恒溫鼓風干燥箱

電熱恒溫震蕩水槽

（2）試劑耗材

試劑名稱

T25細胞培養(yǎng)瓶

血球計數(shù)板

細胞培養(yǎng)孔板

上皮細胞培養(yǎng)體系

0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）

膠原酶Ⅰ( Collagenase Ⅰ)

膠原酶Ⅳ( Collagenase Ⅳ )

2．大鼠甲狀旁腺細胞的分離培養(yǎng)的步驟：

1、首先將4-6周的SD大鼠進行麻醉，在無菌條件下，取下甲狀旁腺組織，然后放入75%酒精中浸泡3-5分鐘。
2、然后在體視顯微鏡下仔細去除包膜、血管及結(jié)締組織等雜質(zhì)。
3、將剩下組織清洗并剪碎。
4、將剪碎的組織置于0.1% 膠原酶Ⅰ與膠原酶 Ⅳ中消化1-2小時。
5、終止消化后，過100μm濾網(wǎng)。
6、收集濾液后，300g離心5分鐘。
7、重懸沉淀，鋪瓶。
3、免疫熒光鑒定的步驟

（1）細胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細胞0.02million個/孔。置培養(yǎng)箱2h或過夜。
（2）固定
細胞爬片后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃過夜。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細胞的一面蓋上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細胞的一面蓋上。
鑒定的細胞為P1代細胞
4、檢驗結(jié)果：