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MDCK細胞培養(yǎng)方法及應(yīng)用

發(fā)布時間:2024/12/9 9:39:47      閱讀次數(shù):101

 

MDCK細胞準備工作

準備工作對開展MDCK細胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應(yīng)給予足夠的重視,準備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試,具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻。

MDCK細胞ATCC細胞圖片

ATCC細胞庫MDCK細胞圖片

逸漠細胞庫MDCK細胞圖片

細胞庫MDCK細胞圖片

MDCK細胞培養(yǎng)實驗準備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌,工作臺開燈通風(fēng)10min,用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材:玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍色100-1000ul)、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿,培養(yǎng)瓶等。

試劑:MEM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

MDCK細胞背景簡介

MDCK細胞系(MDCK CELL LINES)是S.H.MADIN于1958年9月建成,來源于考克斯班尼犬腎臟,該腎臟細胞原代培養(yǎng)時其形態(tài)類似于成纖維細胞,經(jīng)過胰蛋白酶和EDTA混合消化液的連續(xù)6次消化法純化而上皮樣細胞,每次純化間隔時間為7D。培養(yǎng)中MDCK細胞具有遠段腎小管與集合管,來源細胞的分化特性。MDCK細胞株至少有兩種細胞類型,一種命名為C5A,其在含I型膠原的培養(yǎng)物中生長時,能分泌液體,導(dǎo)致囊腫形成,但在塑料面的培養(yǎng)低物上培養(yǎng)時,能分泌液體,卻不能形成囊腫,另一種細胞正好相反。

MDCK細胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基:MEM(ATCC改良)+10%FBS+PS

生長條件:氣相:95%空氣+5%二氧化碳;溫度:37℃

傳代方法:1:2至1:3,每周 2-3次

凍存條件:無血清凍存液(或者冷凍保存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配),液氮儲存

消化時間:1-3min(視細胞情況而定)

MDCK細胞培養(yǎng)注意事項

1.運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)MDCK細胞,請按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。

2.MDCK細胞首次傳代建議1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿,不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

MDCK細胞培養(yǎng)操作

MDCK細胞復(fù)蘇步驟

1.將含有1 mL MDCK犬腎細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,加4 mL培養(yǎng)基混合均勻;

2.在1000 rpm條件下離心4 min,棄去上清液,加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻;

3.將所有MDCK犬腎細胞胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中,加入約4 mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜);

4.第二天換液并檢查MDCK細胞密度。

MDCK細胞傳代步驟

如果MDCK細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗MDCK細胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中,使消化液浸潤所有MDCK細胞,將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min(視細胞情況而定),然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中,1000 rpm離心5 min,棄去上清液,補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

3.將MDCK細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MDCK細胞凍存方法

待MDCK細胞生長狀態(tài)良好時,可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例;

1.收集MDCK細胞及細胞培養(yǎng)液,裝入無菌離心管中,1000 rpm條件下離心4 min,棄去上清液,用PBS清洗一遍,棄盡PBS,進行細胞計數(shù)。

2.根據(jù)MDCK細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液,使細胞密度5×106~1×107/mL,輕輕混勻,每支凍存管凍存1mL細胞懸液,注意凍存管做好標識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱,24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

MDCK細胞應(yīng)用

MDCK細胞被廣泛用作遠曲小管或集合管的模型,還可用于代謝研究和Pg級藥物與藥物相互作用研究以及觀察流感病毒株對細胞功能的影響。

MDCK細胞系(MDCK Cell Lines)廣泛用于多種病毒的擴增和純化,如:(呼腸孤病毒、腺病毒、 犬細小病毒、貓粒細胞缺乏癥病毒)及禽流感病毒等。由于其病毒感染效率高、增殖快,且不易變異,MDCK細胞系被公認為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細胞系之一。

傳統(tǒng)的MDCK細胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式。血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物,其含有細胞生長所需的生長因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其他營養(yǎng)物質(zhì),可以有效地促進細胞生長和產(chǎn)物表達。

用于基于MDCK細胞高密度培養(yǎng)的甲型流感病毒疫苗生產(chǎn)工藝開發(fā)與優(yōu)化研究;

通過考察微載體和血清對細胞生長的影響以及感染參數(shù)對病毒生產(chǎn)效率的影響,確定了基于MDCK細胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)的基本工藝。

研究表明,Cytodex-1和Cytodex-3兩種微載體均能支持MDCK細胞正常貼附生長,胎牛血清(FBS)支持細胞生長的作用顯著優(yōu)于新生小牛血清(NBS)。以2 g/L濃度的Cytodex-1或3 g/L的Cytodex-3為貼附基質(zhì),以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加7.5%(v/v)的FBS便能確保MDCK細胞正常生長,細胞密度可達5.50×106 cells/ml;事關(guān)流感病毒感染復(fù)制的三個關(guān)鍵參數(shù)TPCK-胰酶濃度、MOI和TOI均對病毒增殖具有顯著影響,采用5.0 mg/L的TPCK-胰酶濃度、0.01的MOI和72 h的TOI較為適宜;據(jù)此建立了基于MDCK細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)的流感病毒基本生產(chǎn)工藝,流感病毒HA滴度值達到210.13±0.18 HA units/50μl,單位細胞病毒產(chǎn)率Svy為(6.09±0.44)×103virions/cell。

上述生產(chǎn)工藝雖可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的基本需求,但其生產(chǎn)效率仍有較大提升空間。為了進一步提高生產(chǎn)效率,本文繼而通過考察維持培養(yǎng)基的關(guān)鍵組分對產(chǎn)毒期MDCK細胞密度維持、代謝和病毒增殖的影響,分析了病毒增殖過程對營養(yǎng)代謝的需求,進一步優(yōu)化了維持培養(yǎng)基。

研究表明產(chǎn)毒期的換液操作可顯著提高單位細胞的病毒產(chǎn)率,由此可知在細胞產(chǎn)毒階段改善培養(yǎng)環(huán)境的營養(yǎng)供給對病毒高效增殖尤為重要。


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