小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定教程

一：細(xì)胞簡(jiǎn)介

皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離自腦皮層組織；皮層神經(jīng)元細(xì)胞是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元是具有長(zhǎng)突觸(軸突)的細(xì)胞，它由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。在長(zhǎng)的軸突上套有一層鞘，組成神經(jīng)纖維，它的末端的細(xì)小分支叫做神經(jīng)末梢。細(xì)胞體位于腦、脊髓和神經(jīng)節(jié)中，細(xì)胞突起可延伸至全身各器官和組織中。細(xì)胞體是細(xì)胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4-120微米。核大而圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)少，核仁明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有斑塊狀的核外染色質(zhì)，還有許多神經(jīng)元纖維。細(xì)胞突起是由細(xì)胞體延伸出來(lái)的細(xì)長(zhǎng)部分，又可分為樹(shù)突和軸突。每個(gè)神經(jīng)元可以有一或多個(gè)樹(shù)突，可以接受刺激并將興奮傳入細(xì)胞體。每個(gè)神經(jīng)元只有一個(gè)軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個(gè)神經(jīng)元或其他組織，如肌肉或腺體。皮質(zhì)神經(jīng)元是大腦皮質(zhì)的主要組成細(xì)胞之一，是大腦進(jìn)行功能活動(dòng)調(diào)節(jié)的基本單位，參與動(dòng)物多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察顯示神經(jīng)元從貼壁、伸出突起開(kāi)始；突起逐漸增多，而后突起進(jìn)一步增多并逐漸成網(wǎng)，同時(shí)細(xì)胞胞體增大，周邊光暈明顯。10-12d細(xì)胞最為豐滿，隨后神經(jīng)元開(kāi)始裂解，突起逐漸減少，細(xì)胞已退化變性，輪廓模糊，光暈消失，細(xì)胞變形。

二：實(shí)驗(yàn)工具

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞貼壁培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞添加劑、皮層神經(jīng)元細(xì)胞組織分離液、冰盤(pán)、HBSS緩沖液、胰酶、配好的dmem（500ml dmem+50ml 胎牛血清+5ml雙抗）、尖頭鑷、彎鑷、剪刀、10 cm培養(yǎng)皿、6 cm培養(yǎng)皿、70um細(xì)胞篩、臺(tái)盼藍(lán)、計(jì)數(shù)板

三：操作過(guò)程

提前開(kāi)啟紫外線照射超凈臺(tái)30 分鐘。將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預(yù)溫10-30 分鐘。紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺(tái)，超凈臺(tái)通風(fēng)10 分鐘以上。 包板：將10x的多聚賴氨酸（PLL）稀釋成1x的工作液，每個(gè)六孔板加入2mL晃動(dòng)，鋪滿底部。過(guò)夜，洗2-3次。 （消化前的步驟在冰盤(pán)上操作）
   1. 準(zhǔn)備試劑：準(zhǔn)備5個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，5個(gè)6 cm培養(yǎng)皿置于冰上，倒入HBSS。
   2. 取胎鼠：取E17.5天（14.5-17.5天  大了會(huì)有膠質(zhì)細(xì)胞）的孕鼠，處死后酒精消毒孕鼠，用手術(shù)剪剪開(kāi)孕鼠腹部，將子宮取出，放入10 cm培養(yǎng)皿。
   3. 洗子宮：將取出的子宮在剩余10 cm培養(yǎng)皿中洗3-4次，將胎鼠取出放入另一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿。
   4. 取腦子：用尖頭鑷剝離胎鼠頭部及腦殼，取出腦子黑色畫(huà)圈部分，放入6 cm培養(yǎng)皿。
   5. 剝腦膜：將一個(gè)腦移至一個(gè)新的6 cm培養(yǎng)皿（兩三個(gè)腦子用一個(gè)6 cm培養(yǎng)皿，防止太久HBSS升溫），在解剖鏡下去除嗅球（綠色的部分），小腦及兩個(gè)大腦半球中間的連接物，將剝干凈的皮層放入新的6 cm培養(yǎng)皿。
   6. 消化：全部剝完后，吸走HBSS，用鑷子夾碎腦袋，夾至漿糊狀，每個(gè)腦子加入1ml皮層神經(jīng)元細(xì)胞組織分離液，五個(gè)腦子一組，吹打均勻后，放入10 cm培養(yǎng)皿中，37℃消化12min（避免一個(gè)10 cm培養(yǎng)皿放入太多腦子，避免離心管消化，會(huì)導(dǎo)致消化不均勻）。
   7. 終止消化：立即加入等量的配好的貼壁培養(yǎng)基終止消化，用5mL槍頭吹打12下。
   8. 過(guò)篩：將終止消化后的溶液，用細(xì)胞篩過(guò)濾。
   9. 重懸：1000G離心5min，去除上清，以每個(gè)腦子加入1ml配好的貼壁培養(yǎng)基，重懸。
   10. 計(jì)數(shù)：吹打均勻后，取10ul細(xì)胞稀釋液，10ul 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，混勻，計(jì)數(shù)。
   11. 種板：每個(gè)六孔板，每孔1.0-1.2*10^6個(gè)，12孔板每孔5-6*10^5個(gè)，10 cm培養(yǎng)皿1.2-1.5*10^7
   12. 換液：種板4小時(shí)左右換液，此時(shí)用配好的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基。
   13. 培養(yǎng)：每3天換一次液。

四：細(xì)胞鑒定

1、形態(tài)觀察

小鼠神經(jīng)元細(xì)胞接種 于細(xì)胞培養(yǎng)板中后，可見(jiàn)大而圓的神經(jīng)元細(xì)胞，6 h 可觀察到明顯的細(xì)胞突起，隨后可見(jiàn)粗大的軸突形 成；40 h 左右神經(jīng)元細(xì)胞軸突形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸密集， 此時(shí)可見(jiàn)部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始明顯增多， 應(yīng)立即加入阿糖胞苷以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分裂增殖，此后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。培養(yǎng)第 5 d時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)最為典型），其軸突和樹(shù)突交織成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 典型成熟的神經(jīng)元具有大而清晰的核，主要特征為具有圓錐形長(zhǎng)突起，軸突的直徑全長(zhǎng)均一，而樹(shù)突的直徑從胞體向末梢逐漸變細(xì)。

2、標(biāo)志物鑒定

皮層神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。