4T1細(xì)胞背景簡介

4T1細(xì)胞是從410.4瘤株中未經(jīng)誘變篩得的6-硫鳥嘌噙抗性細(xì)胞株。當(dāng)4T1細(xì)胞注射到BALB/c小鼠中時(shí)，4T1細(xì)胞會自發(fā)產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移腫瘤，可轉(zhuǎn)移到肺、肝、淋巴結(jié)和大腦，同時(shí)在注射部位形成始發(fā)灶，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移時(shí)不需要摘除始發(fā)灶。4T1細(xì)胞在BALB/c小鼠中的生長與轉(zhuǎn)移特性與人體中的乳腺癌十分相近，這種腫瘤是人Ⅵ期乳腺癌的動(dòng)物模型。4T1細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤在手術(shù)后及未手術(shù)情況下轉(zhuǎn)移的動(dòng)力學(xué)相近，可以用作手術(shù)后及未手術(shù)模型。4T1細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤模型跟其他腫瘤模型相比，由于4T1細(xì)胞的抗6-硫鳥嘌噙特性，微小的轉(zhuǎn)移細(xì)胞團(tuán)（少到僅僅1個(gè)）也可以在許多遠(yuǎn)端器官中檢測到，沒必要數(shù)淋巴結(jié)或稱重器官。

小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1形態(tài)

ATCC細(xì)胞庫4T1細(xì)胞圖片

ATCC細(xì)胞庫4T1細(xì)胞圖片

4T1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭（白色0-10ul；黃色20-200ul；藍(lán)色100-1000ul）、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：DMEM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

4T1細(xì)胞培養(yǎng)條件

形態(tài)特征：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長

培養(yǎng)基： 90%DMEM+10% FBS+PS

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃

傳代方法：1:2至1:3，每周 3次

凍存條件：無血清凍存液（或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配），液氮儲存

4T1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1.運(yùn)輸4T1細(xì)胞用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

2.收到4T1細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代 。注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

4T1細(xì)胞養(yǎng)操作步驟

4T1細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.將含有1 mL4T1細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻；

2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后輕輕吹勻；

3.將所有4T1細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）；

4.第三天換液并檢查4T1細(xì)胞密度。

4T1細(xì)胞傳代方法

如果4T1細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min(視細(xì)胞消化情況而定)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

3.將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4T1細(xì)胞凍存方法

待4T1細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例

1.收集4T1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)4T1細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.小鼠4T1細(xì)胞不長怎么處理？

這些因素都會影響細(xì)胞長得慢：a.沒有保證密度，細(xì)胞長不起來；b.操作時(shí)力度沒控制好，將細(xì)胞吹碎，狀態(tài)變差；c.血清質(zhì)量不好，影響細(xì)胞生長。

2.4t1細(xì)胞形態(tài)特征？

4T1細(xì)胞形態(tài)特征為上皮細(xì)胞樣，貼壁生長。

3.4t1細(xì)胞用高糖DMEM嗎？

是的，用高糖DMEM。

4.4T1細(xì)胞能成瘤嗎？

Yes，forms tumors and metastasizes in BALB/c mice.

5.小鼠4T1細(xì)胞傳代密度是多少？

4T1細(xì)胞建議在生長至80%匯合度時(shí)即應(yīng)傳代，以免細(xì)胞狀態(tài)變差。

6.4T1細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點(diǎn)，怎么處理？

如果在顯微鏡下觀察到了小黑點(diǎn)，基本上可以將范圍縮小到是細(xì)菌污染或者細(xì)胞碎片這兩種情況。

到底是污染還是碎片，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行判斷：

1) 運(yùn)動(dòng)性

很多會動(dòng)的小黑點(diǎn)，只是發(fā)生布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞碎片。在顯微鏡下觀察黑點(diǎn)大小和形狀是否規(guī)則，是否運(yùn)動(dòng)，是做布朗運(yùn)動(dòng)還是呈直線型快速移動(dòng)。如果黑點(diǎn)大小不規(guī)則，做布朗運(yùn)動(dòng)，黑點(diǎn)可能是細(xì)胞碎片（可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的），也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。

處理方法：消化離心棄上清后，PBS重懸洗洗，750rpm低速離心4分鐘，重新鋪下，鋪回去鏡下觀察一下是不是干凈的

如果黑點(diǎn)大小一致，快速移動(dòng)，很可能是細(xì)菌污染。

2）培養(yǎng)基的渾濁度

如果在顯微鏡下無法辨認(rèn)，那就交給時(shí)間吧。細(xì)胞培養(yǎng)基對于細(xì)菌來說是非常營養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細(xì)菌就會大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會變渾濁。通常在12小時(shí)內(nèi)就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時(shí)內(nèi)就非常明顯。