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發(fā)布時(shí)間:2024/12/16 9:45:05 閱讀次數(shù):101
THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。它來自一位急性單核細(xì)胞白血病患者的血液,有分化為多種巨噬細(xì)胞的能力,是各領(lǐng)域研究常用的細(xì)胞系之一。
THP-1是人外周血的單核細(xì)胞系,最初來源于急性單核細(xì)胞性白血病患者。屬于懸浮細(xì)胞,適合用于轉(zhuǎn)染或感染實(shí)驗(yàn)。其表面抗原HLA型為:A2,A9,B5,DRw1,DRw2。
ATCC細(xì)胞庫THP-1細(xì)胞圖片
細(xì)胞庫THP-1細(xì)胞圖片
1.THP-1細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng),部分細(xì)胞聚集成團(tuán),部分細(xì)胞分散。
2.THP-1細(xì)胞喜歡酸性環(huán)境
在偏酸性環(huán)境中,THP-1生長(zhǎng)更快,所以當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃(呈橘紅色)時(shí),是適合細(xì)胞生長(zhǎng)的,此時(shí)補(bǔ)液或半換液即可。
3.THP-1細(xì)胞有密度依賴性
THP-1細(xì)胞密度低時(shí),生長(zhǎng)較慢,培養(yǎng)密度維持在50萬-100萬細(xì)胞/毫升為宜;超過200萬/毫升則需要傳代。
4.THP-1細(xì)胞對(duì)血清要求高
血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化,建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。選擇品質(zhì)好的血清更有利于THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)。
提前開啟紫外照射30min消毒滅菌,工作臺(tái)開燈通風(fēng)10min,用75%酒精擦拭臺(tái)面。
器材耗材:玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、培養(yǎng)瓶等。
試劑:1640培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素、2-巰基乙醇。
THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基:90% 1640+10% FBS+PS+ 0.05 mM 2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)
THP-1細(xì)胞傳代比例:1:2至1:3,每周 2-3次
THP-1細(xì)胞代次密度:如果THP-1細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)
生長(zhǎng)條件:氣相:95%空氣+5%二氧化碳;溫度:37℃
凍存條件:無血清凍存液(或者冷凍保存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配),液氮儲(chǔ)存
消化時(shí)間:1-3min(視細(xì)胞情況而定)
THP-1屬于懸浮細(xì)胞,顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓形,透明度高,背景干凈,碎片很少,說明細(xì)胞狀態(tài)很好。
2.THP-1常用RPMI 1640培養(yǎng)基,含10%胎牛血清,在37度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。特別注意的是THP-1喜歡酸性環(huán)境,對(duì)培養(yǎng)基pH值的變化很敏感,通常培養(yǎng)基顏色呈橘紅色時(shí)細(xì)胞最適宜生長(zhǎng)。所以盡量使用相同Ph的1640。
3.THP-1細(xì)胞有密度依賴性,低密度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)慢,建議細(xì)胞量維持在每毫升50-100萬為宜,超過10^6/ml即可傳代,傳代比例采用1:3~1:4,換液不需要太頻繁,正常2~3天換1次液即可。
注意細(xì)胞的密度一定要高,介于5×105—— 106/ML之間,增值的快。細(xì)胞數(shù)量太少,不適合THP-1生長(zhǎng),一般狀態(tài)不好的THP-1在培養(yǎng)了3天后數(shù)量仍然不多,繼續(xù)培養(yǎng)一天或者兩天,培養(yǎng)基嚴(yán)重泛黃,細(xì)胞數(shù)會(huì)增加。這一點(diǎn)不同于同是單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞。
4.傳代后切忌常移出培養(yǎng)箱觀察,否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),狀態(tài)變差,一般首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒變多。一般THP-1 生長(zhǎng)相當(dāng)快,對(duì)于狀態(tài)已經(jīng)不好的情況,建議傳代后3~4天再觀察,一般4天時(shí)間培養(yǎng)基已明顯泛黃,細(xì)胞數(shù)量巨增
5.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要添加0.05mM的β-巰基乙醇。
6.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)有部分細(xì)胞聚團(tuán)生長(zhǎng),若細(xì)胞團(tuán)塊過大過多,應(yīng)當(dāng)輕輕將其吹散。
THP-1細(xì)胞復(fù)蘇方法
1.將含有1 mLTHP-1細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍;
2.THP-1細(xì)胞在1000 rpm條件下離心3 min,棄去上清液,加1 mL 10%FBS 1640培養(yǎng)基后吹勻;
3.將所有THP-1細(xì)胞懸液加入6 cm皿中,加入約4 mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜;
4.第二天檢查THP-1細(xì)胞密度。
THP-1細(xì)胞傳代步驟
如果THP-1細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
方法一
收集THP-1細(xì)胞,1000RPM條件下離心3-5min分鐘,棄去上清液
補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,將THP-1細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含10ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
方法二
可選擇半數(shù)換液方式,棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起
將THP-1細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
備注:第一次傳代時(shí),若培養(yǎng)基中有細(xì)胞碎片,則將細(xì)胞懸液裝入無菌離心管中,1000 rpm離心4 min,棄去上清液,補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻,按1:1分到新的裝有10mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
THP-1細(xì)胞凍存步驟
待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面10cm皿為例;
1.收集THP-1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,裝入無菌離心管中,1000 rpm條件下離心4 min,棄去上清液,加 1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)THP-1細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液,使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL,輕輕混勻,每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管放入-80℃冰箱,24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
1.THP-1細(xì)胞凍存過后復(fù)蘇困難怎么辦?
a.凍存前細(xì)胞狀態(tài)較好, 凍存總量不低于1*106/支
b.復(fù)蘇后細(xì)胞接種密度建議3*106/ml
c.如有細(xì)胞碎片,待細(xì)胞密度增大后通過低速離心去除
2.THP-1細(xì)胞收貨時(shí)出現(xiàn)偽足,或是碎片較多怎么辦?
受到運(yùn)輸影響,懸浮細(xì)胞會(huì)短暫性出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象,如偽足等。通過傳代培養(yǎng),1周左右可以恢復(fù)正常。一些THP-1細(xì)胞在運(yùn)輸途中死亡而產(chǎn)生碎片,通過傳代離心可以去除。
處理方法
收集THP-1細(xì)胞,1000RPM條件下離心3-5min分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液重新分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生貼壁怎么處理?
THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞貼壁屬于正常情況,不需要擔(dān)心。可以輕吹收集細(xì)胞或者丟棄貼壁部分細(xì)胞。
處理方法
只需將THP-1細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中即可。但如果當(dāng)貼壁細(xì)胞的比例高于20%,說明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有異常,這時(shí)候就需要排查培養(yǎng)箱設(shè)置、培養(yǎng)基成分,以及培養(yǎng)器皿是否異常。
4.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)怎么辦?
THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞聚團(tuán),呈葡萄串狀,屬于正,F(xiàn)象,特別是THP-1細(xì)胞密度較低時(shí),易出現(xiàn)這種情況。
處理方法
可以更換血清品牌或增大血清比例(不超過20%)有助于解決聚團(tuán)問題。不建議將聚團(tuán)的細(xì)胞吹散,等待密度高時(shí),會(huì)自己分散開。
5.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基里一定要加β-巰基乙醇嗎?
β-巰基乙醇是一種常用的培養(yǎng)補(bǔ)充劑,有抗氧化的作用,可減少氧化應(yīng)激對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。當(dāng)細(xì)胞密度過大但需要維持時(shí),可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例(不超過標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍)。
6.THP-1細(xì)胞鏡下觀察時(shí),難以聚焦或估算密度怎么辦?
THP-1細(xì)胞形態(tài)特征懸浮生長(zhǎng),懸浮細(xì)胞會(huì)隨著液體流動(dòng),不容易聚焦,靜置5-10分鐘使細(xì)胞沉底,之后再輕輕放上顯微鏡觀察,將有助于聚焦和估算細(xì)胞密度。
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