小鼠主動脈內(nèi)皮細胞MAEC培養(yǎng)說明書

一 細胞培養(yǎng)條件

二 細胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法.收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶,消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴格無菌操作,將細胞瓶放入37℃ 5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認收到狀態(tài)良好.（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時要將蓋子擰松,傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基,另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基,以便進行對比培養(yǎng)）

三 細胞培養(yǎng)步驟

a 細胞傳代：如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%,即可進行傳代培養(yǎng),傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸.

4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

b 細胞凍存： 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞MAEC培養(yǎng)說明書

1 細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞一次；

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；

3 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,混勻后加入凍存管中.

4 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中.

C 細胞復(fù)蘇：

1 從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；

3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

四 注意事項：有些細胞貼壁不牢,在運輸過程中發(fā)生容易細胞脫落,這是正�，F(xiàn)象.請將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

五 售后條款：

1）細胞出現(xiàn)問題,可重發(fā)的情況有哪些？判定標準是什么？

1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題,細胞丟失 瓶身破損 培養(yǎng)液嚴重漏液等,重發(fā)；

2. 細胞污染問題,請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),給我們提出真實的實驗結(jié)果,核實后重發(fā)；

3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后,干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后,絕大多數(shù)細胞未存活,（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片）,重發(fā)；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,出現(xiàn)污染,重發(fā)；

5. 細胞活性問題,請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果,用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,核實后予重發(fā)；

6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照,3天未告知的,視為產(chǎn)品合格.4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關(guān)操作的詳細步驟的,并跟技術(shù)人員溝通的,由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,重發(fā).技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā).

2）細胞出現(xiàn)問題,不予以重發(fā)的情況有哪些？

1. 客戶造成細胞污染,不重發(fā)；

2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；

3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；

4. 細胞狀態(tài)不好,未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的,不重發(fā)；

5. 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的,不重發(fā)；

6. 細胞收到2天內(nèi),未告知,不重發(fā)；

7. 視具體情況而定.  小鼠主動脈內(nèi)皮細胞MAEC培養(yǎng)說明書