小鼠肝癌細(xì)胞帶熒光素酶H22/LUC培養(yǎng)說明書

一 細(xì)胞培養(yǎng)條件

二 細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法.收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶,消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,將細(xì)胞瓶放入37℃ 5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好.（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)要將蓋子擰松,傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基,另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基,以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)）

三 細(xì)胞培養(yǎng)步驟

細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時(shí),將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代具體步驟如下細(xì)胞傳代：

A1 對(duì)于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中.

方法二：可選擇半數(shù)換液方式,棄半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中.

A2 懸浮細(xì)胞凍存： 小鼠肝癌細(xì)胞帶熒光素酶H22/LUC培養(yǎng)說明書

1 細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),將T25 培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm

離心5min；

2 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml/支的雅吉生物無血清凍存液（C7001）,混勻后加入凍存管中.（如：凍一支,加入 1ml 無血清凍存液即可）

3 將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可；如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,需在-80℃冰箱存

放 24 小時(shí)以上.

B1 對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考如下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細(xì)胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸.

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶）,補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

B2 貼壁細(xì)胞凍存： 小鼠肝癌細(xì)胞帶熒光素酶H22/LUC培養(yǎng)說明書

1 細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次；

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；

3 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號(hào)：C7001）,混勻后加入凍存管中.

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細(xì)胞復(fù)蘇：

1 從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；

3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

四 注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞貼壁不牢,在運(yùn)輸過程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落,這是正常現(xiàn)象.可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25）,補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

售后服務(wù)告知書

1）細(xì)胞出現(xiàn)問題,可重發(fā)的情況有哪些？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么？

1. 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問題,細(xì)胞丟失 瓶身破損 培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,重發(fā)；

2. 細(xì)胞污染問題,請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品48小時(shí)內(nèi),給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,核實(shí)后重發(fā)；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時(shí)后,干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后,絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）,重發(fā)；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時(shí)候并且未開封,出現(xiàn)污染,重發(fā)；

5. 細(xì)胞活性問題,請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,核實(shí)后予重發(fā)；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請(qǐng)拍照,3天未告知的,視為產(chǎn)品合格.4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時(shí)照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的,并跟技術(shù)人員溝通的,由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,重發(fā).技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價(jià)的50%收費(fèi)重發(fā).

二）細(xì)胞出現(xiàn)問題,不予以重發(fā)的情況有哪些？

1. 客戶造成細(xì)胞污染,不重發(fā)；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；

3. 非本庫(kù)推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,不重發(fā)；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好,未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,不重發(fā)；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的,不重發(fā)；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi),未告知,不重發(fā)；

7. 視具體情況而定. 

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