小鼠胚胎干細(xì)胞E14培養(yǎng)說(shuō)明書ES-E14TG2a

 細(xì)胞描述：

小鼠胚胎干細(xì)胞.該細(xì)胞缺乏 HGPRT（HPRT）,并且對(duì) 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性.當(dāng)在飼養(yǎng)層（胚胎成纖維細(xì)胞或 STO 細(xì)胞）上培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞保持未分化狀態(tài).在沒有飼養(yǎng)層的情況下,細(xì)胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu).當(dāng)注入胚泡中時(shí),細(xì)胞可以進(jìn)入生殖系.在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后,它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎.培養(yǎng)時(shí)需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞.

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：小鼠,129/Ola品系,胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10⁶  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸：1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈 凍存管瓶蓋脫落 破損及細(xì)胞有污染,請(qǐng)立即與我們聯(lián)系.

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (0001)         81%      

優(yōu)質(zhì)胎牛血清 （0500）             15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺  ( 0900 )         1 %

MEM NEAA非必需氨基酸 (01000)      1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 ( 01100 )      1%

P/S青霉素-鏈霉素 （15140-122）       1%

β-巰基乙醇  (8211)                    0.5 mL（1000X)

LIF  (50756)                         5μg（10ng/mL）

使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞.

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,95%；二氧化碳,5%. 溫度：37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%.

3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%,FBS 30%%,DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配.

我?guī)靸龃鏁r(shí),體積為 500 μl,預(yù)期存活率 70%,每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇,3 至4 天后,會(huì)形成 30 至 40 個(gè)克隆,建議復(fù)蘇至 1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中.

二：細(xì)胞處理：

MEF 細(xì)胞鋪制：

1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上.

2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養(yǎng)液.一般地,一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yǎng)液.

3.  按實(shí)驗(yàn)需要：小鼠胚胎干細(xì)胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復(fù)蘇 MEF 細(xì)胞若干支.將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.

4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi),以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完全培養(yǎng)液 1 ml,重懸后按照一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶鋪 1´106 的 MEF 細(xì)胞,平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱.24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞.

5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞前,將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完全培養(yǎng)液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液待用.

復(fù)蘇：

1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.

2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心 5 min.

3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml,吹打懸浮.

4. 重復(fù)吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡.

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).

6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液.

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液.

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍.

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動(dòng),使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞.

5. 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）.

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化.

7.  以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清.

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液,多次輕輕吹打細(xì)胞, 制成單細(xì)胞懸液.

9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液,吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中.一般地,一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液.放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).每天換液.

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái),制成細(xì)胞懸液.

2.  以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞.

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱 代數(shù) 凍存日期等基本信息.

4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過(guò)夜,轉(zhuǎn)入液氮.

凍存液配方：

小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 60%,ES 級(jí) FBS 30%,DMSO 10%

  小鼠胚胎干細(xì)胞E14培養(yǎng)說(shuō)明書

附：小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）：

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞,按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到無(wú) MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地,一個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞,在一個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁.不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過(guò)快無(wú)法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中.

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時(shí).

3.  1 小時(shí)后,絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中.收取培養(yǎng)液,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

注意事項(xiàng)：

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作,并請(qǐng)注意防護(hù),所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄.

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套 衣服和戴上防護(hù)面罩.注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏,并會(huì)慢慢充滿液氮.解凍時(shí),液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子,從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害. 小鼠胚胎干細(xì)胞E14培養(yǎng)說(shuō)明書