本試劑盒僅供研究使用.       

1 使用目的：

本試劑盒用于魚 蝦和肉類組織（如雞 牛肉和豬肉）,雞蛋 蜂蜜 牛奶等樣本中呋喃西林代謝物（SEM）殘留的定量檢測.

2 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競爭ELISA方法,在微孔板包被有呋喃西林代謝物（SEM）偶聯(lián)抗原,加入呋喃西林代謝物（SEM）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品,游離呋喃西林代謝物（SEM）與微孔條上預(yù)包被的呋喃西林代謝物（SEM）偶聯(lián)抗原互相競爭抗呋喃西林代謝物（SEM）抗體酶標(biāo)記物,用TMB底物顯色,加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色,用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測,吸光值與樣品中呋喃西林代謝物（SEM）含量成反比,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中呋喃西林代謝物（SEM）的含量.  

3 試劑盒組成

3.1 預(yù)包被的呋喃西林代謝物（SEM）偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）.

3.2 呋喃西林代謝物（SEM）標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶）,含量分別是： 0 ppb,0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb.

3.3抗呋喃西林代謝物（SEM）抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）.

3.4顯色液A：1瓶（6ml）.

3.5顯色液B：1瓶（6ml）.

3.6終止液：1瓶（6ml）,2M硫酸.

3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,  6ml）,用于樣品稀釋用.

3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×,20ml）,用于洗板.

3.9說明書一份.

4 需要而未提供的材料

4.1 設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀.

4.1.2粉碎機(jī).

4.1.3量筒.

4.1.4振蕩器.

4.1.5漏斗.

4.1.6Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙.

4.1.7微量移液器.

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水.

4.2.2 甲醇.

5 貯存 呋喃西林代謝物（SEM）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書

5.1 試劑盒貯存于2~8℃,切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6 注意事項(xiàng)

6.1 使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書.

6.2 不要使用過期試劑盒.

6.3 試劑盒使用前,將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃）,建議至少回溫2小時(shí).

6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有呋喃西林代謝物（SEM）,使用時(shí)應(yīng)特別注意,操作時(shí)應(yīng)帶手套.

6.5 終止液中含有硫酸,使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物.

6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品 樣品所用吸頭不能混用,否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果.

6.7 不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品 樣品所用吸頭不得混用,否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡.

7 工作液準(zhǔn)備

7.1 呋喃西林代謝物（SEM）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用

7.3 顯色劑：已備用,避免光線直照

7.4 反應(yīng)終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,要嚴(yán)格按說明書操作,提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋,否則會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品,加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用Whatman No 1濾紙過濾

8.4取25µl處理后的樣品,加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實(shí)驗(yàn)須知

9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,時(shí)間約2小時(shí).回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條,多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分,否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度.

9.1.2 使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請(qǐng)不要改變分析程序

9.1.4 請(qǐng)使用精確的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始,請(qǐng)不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號(hào),標(biāo)記B0 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,推薦進(jìn)行雙孔檢測

9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆）,將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×） 濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）

9.2.4 在B0孔中加入50µl  0.0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗呋喃西林代謝物（SEM）抗體酶結(jié)合物

9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘.

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板,可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體,用洗液洗滌微孔板5次,最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體.

9.4 反應(yīng)

9.4.1 洗滌程序完成后,立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A,再加 50µl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之徹底混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50µl終止液,混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度,結(jié)果在5min內(nèi)讀取.

10 結(jié)果計(jì)算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%,即百分吸光度值.

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以呋喃西林代謝物（SEM）濃度的對(duì)數(shù)值為X軸,百分吸光度值為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.根據(jù)樣品百分吸光度值,可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo),即為呋喃西林代謝物（SEM）濃度的對(duì)數(shù)值,求得反對(duì)數(shù)即為測定液中呋喃西林代謝物（SEM）濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋,因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù).

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值.

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較,判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值.

11 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)

呋喃西林代謝物 ————— 100%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.05ppb 

B0吸光度最佳值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％,板間誤差小于15％.

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％.

13

試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb.

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證.