呋喃西林代謝物檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)蜂蜜 組織 牛奶 飼料等中的呋喃西林代謝物（SEM）,試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板 辣根酶標(biāo)記物 抗體 標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成.檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的呋喃西林代謝物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃西林代謝物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含呋喃西林代謝物含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃西林代謝物的殘留量.

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃,45min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

組織 肝臟 雞蛋…………………0.1ppb

蜂蜜 牛奶 腸衣…………………0.1ppb

奶粉 蛋粉 飼料…………………0.1ppb

熟食…………………………………0.1ppb

魚(yú)/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾,定量下限為0.15ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

呋喃西林代謝物…………………100%

呋喃唑酮代謝物…………………<0.1%

呋喃妥因代謝物…………………<0.1%

呋喃它酮代謝物…………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

組織 肝臟 雞蛋…………………90±15%

蜂蜜 牛奶 腸衣…………………80±15%

奶粉 蛋粉 飼料…………………85±25%

熟食…………………………………80±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb 0.05ppb 0.15ppb 0.45ppb 1.35ppb 4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml

衍生化試劑（黑蓋） ………………10ml

酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2×復(fù)溶液（黃蓋） …………………50ml

說(shuō)明書(shū) ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀 打印機(jī) 均質(zhì)器 氮?dú)獯蹈裳b置 振蕩器 離心機(jī) 刻度移液管 天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl,100µl-1000µl 多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯 正己烷 氫氧化鈉 濃HCl K₂HPO₄·3H₂O 亞硝基鐵氰化鈉（Na₂Fe(CN)₅(NO)_▪2H₂O） 硫酸鋅ZnSO₄·7H₂O 乙腈 甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵氰化鈉溶液

10.7g亞硝基鐵氰化鈉加去離子水混勻溶解,定容至100ml.

配液2：1.04M硫酸鋅溶液

    29.8g硫酸鋅加去離子水混勻溶解,定容至100ml.

配液3：0.1M  K₂HPO₄ 溶液

    稱11.4g K₂HPO_4▪3H₂O加去離子水混勻溶解,定溶至500ml.

配液4：1M  HCL

    8.6mL濃HCL加去離子水混勻,定容至100mL.

配液5：1M  NaOH溶液

    稱取4g NaOH,加去離子水混勻,定容至100ml.

配液6：復(fù)溶液

將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份復(fù)溶液加1份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月.

配液7:工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水).

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 牛奶樣本處理方法

1）取5ml樣本于離心管中,加250ul 亞硝基鐵氰化鈉溶液（配液1）振蕩混合30秒,加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上清1.1ml,加4ml去離子水 0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘；

3）在37℃過(guò)夜孵育(約16小時(shí))或50℃（超過(guò)50℃時(shí)會(huì)影響分層效果）水浴孵育3小時(shí)；

4）分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯,振蕩5分鐘；

5）室溫下4000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘；

6）取出2.5ml的上層液到另一個(gè)離心管中,50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/p>

7）用1ml正已烷溶解殘留物,加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘；

8）去除上層正已烷,取50μl下層液用于分析.

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測(cè)下限：0.1ppb

5.3.2 奶粉 蛋粉樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,加入4ml去離子水 0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘；

2）在37℃過(guò)夜孵育(約16小時(shí))或50℃（超過(guò)50℃時(shí)會(huì)影響分層效果）水浴孵育3小時(shí)；

3）加250ul 亞硝基鐵氰化鈉溶液（配液1）振蕩混合30秒,加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒,15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

4）取全部上清到另一個(gè)離心管中,后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,4）”

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測(cè)下限：0.1ppb

5.3.3 蜂蜜 組織 腸衣 肝臟 飼料 雞蛋樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,加入4ml去離子水 0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘；

2）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,3）”

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測(cè)下限：0.1ppb

5.3.4 熟食樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中,加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水,振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,去除全部液體；

2）加入5ml乙腈和5ml正己烷,振蕩2min,室溫4000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,去除全部液體；

3）在沉淀中加入4ml去離子水 0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,振蕩5分鐘；

    注：熟食的添加回收試驗(yàn)請(qǐng)?jiān)诖瞬郊尤敫邩?biāo)準(zhǔn)品.

4）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,3）”

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測(cè)下限：0.1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻.取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃.

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置.

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)45分鐘.

6.3 洗    滌：小心揭開(kāi)蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干（用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）.

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）.

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng).

6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）.測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成.

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,再乘以100%,即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖.將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度.

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確 快速分析.（歡迎來(lái)電索�。�

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低.

8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象.所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作.

8.3 混合要均勻,洗板要徹底,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性.

8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射.

8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑.

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之.0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí),表示試劑可能變質(zhì).

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚.

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍.

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒.