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發(fā)布時(shí)間:2024/7/1 9:44:15 閱讀次數(shù):409
人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥株(ASPC-1/GEM)
細(xì)胞介紹
一個(gè)胰腺癌病人的腹水中的細(xì)胞移植到裸鼠后建立了這個(gè)細(xì)胞株.
細(xì)胞特性
1) 來源:ASPC-1耐藥篩選
2) 形態(tài):上皮細(xì)胞樣,貼壁生長
3) 含量:>1×106 細(xì)胞數(shù)
4) 用途:僅供科研使用
細(xì)胞運(yùn)輸 保存及注意事項(xiàng)
| 復(fù)蘇細(xì)胞 | 凍存細(xì)胞 |
包裝 | 充液的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 | 1mL凍存管 |
運(yùn)輸條件 | 常溫 | 干冰 |
保存方式 | 75%酒精消毒瓶壁,置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 | -80℃冰箱中保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮/立即復(fù)蘇 |
注意事項(xiàng) | 1. 收到細(xì)胞請先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀 細(xì)胞的狀態(tài),進(jìn)行拍照并保存,如有問題請及時(shí)聯(lián)系我們; 2. 收到的復(fù)蘇細(xì)胞,若有較多細(xì)胞飄起,可能由于運(yùn)輸導(dǎo)致.請先置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h,待細(xì)胞貼壁后再做處理; 3. 復(fù)蘇細(xì)胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基,收到細(xì)胞后請及時(shí)更換為完全培養(yǎng)基; 4. 建議收到細(xì)胞后,首先進(jìn)行擴(kuò)增,并凍存部分細(xì)胞以備用. |
細(xì)胞耐藥誘導(dǎo)過程
待細(xì)胞生長穩(wěn)定后,開始倍增藥物誘導(dǎo)劑量,每個(gè)劑量保持至細(xì)胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達(dá)50%以上.遞增藥物濃度依次為:0.03μg/mL 0.3μg/mL 1.5μg/mL 3μg/mL 6μg/mL 12μg/mL 18μg/mL.約10個(gè)月后,細(xì)胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長,視為耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功,并命名為ASPC-1/GEM.
細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制
1)GEM藥物的配制及保存
建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液:即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物,使其完全溶解.
注意:可根據(jù)用量配置藥物,并將藥物分裝保存,避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效.溶解后的GEM,4℃保存1周,-20℃保存1個(gè)月,-80℃保存6個(gè)月.
2)凍存液的配制
90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配.
3)完全培養(yǎng)基的配制(推薦使用h005-001b)
成分 | 體積/濃度 |
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 | 10% |
雙抗 | 1% |
GlutaMAX-1谷氨酰胺 | 1% |
GEM | 0~18μg/mL |
DMEM培養(yǎng)基 | 補(bǔ)充至所需體積 |
細(xì)胞培養(yǎng)條件
氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%;溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%~80%.
細(xì)胞處理
1)凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,1000rpm/min離心3~5min,棄去上清液.加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中,置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,2~3day換液.
注意:①細(xì)胞復(fù)蘇過程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細(xì)胞完全貼壁,形態(tài)完全展開,生長狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物.若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢,可適當(dāng)降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí),再更換為所需的GEM濃度;
②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終穿戴防護(hù)手套和面罩,避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸,造成人員傷害.
2)細(xì)胞傳代(建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1:2比例傳代)
①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí),即可進(jìn)行傳代培養(yǎng).
②棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次,吸凈殘余的PBS.
③加入適當(dāng)體積的0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中(T25瓶-1mL,其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可),置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min,顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落,即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落.迅速拿回操作臺,加入2倍體積的 含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化.
④將細(xì)胞懸液移入離心管中,1000rpm/min離心5min,棄去上清液.
⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,輕吹混勻.將細(xì)胞懸液按1:1的比例均勻鋪于2個(gè)新的培養(yǎng)瓶/皿中,添加6~8mL完全培養(yǎng)基,置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,2~3day換液.
注意:細(xì)胞傳代過程中,不可使用含有藥物的培養(yǎng)基.須在細(xì)胞完全貼壁,形態(tài)完全展開,生長狀態(tài)穩(wěn)定后,方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加GEM藥物.若加藥后細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢,可適當(dāng)降低GEM的濃度,或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí),再更換為所需的GEM濃度.
3)細(xì)胞凍存
①細(xì)胞凍存時(shí),步驟同2)細(xì)胞傳代的①~④,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,加入配制好的細(xì)胞凍存液,重懸細(xì)胞,按照1×106 ~ 1×107個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中,標(biāo)注好名稱 代數(shù) 日期等信息.
②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,-80℃冰箱中過夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存.同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用.
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