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新品推薦:單純皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒

發(fā)布時間:2024/11/7 9:01:37      閱讀次數(shù):216

產(chǎn)品及特點

單純皰疹病毒1型染料法熒光定量PCR試劑盒可用于檢測單純皰疹病毒 1 型.單純皰疹是一種由單純皰疹病毒所致的病 毒性皮膚病,中醫(yī)稱為熱瘡.能引起人類多種疾病,如齦口炎 角膜結(jié)膜炎 腦炎以及 生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染.在感染宿主后,常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染,激活后 又會出現(xiàn)無癥狀的排毒,在人群中維持傳播鏈,周而復(fù)始的循環(huán).單純皰疹病毒 1 型是 單純皰疹病毒的一類,可通過呼吸道 皮膚接觸等傳染,并且是口腔疾病的主要病原體. 本產(chǎn)品是根據(jù)染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的單純皰疹病毒 1 型檢測試劑盒,它具有下 列特點:

1.   即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板.

2.   引物等組分經(jīng)過優(yōu)化,靈敏度高.

3.   提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品.

4.   特異性高,引物是根據(jù)單純皰疹病毒 1  DNA 度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他微 生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng).

5.   既可用于定性檢測,又可用于定量檢測.用于定量檢測時線性范圍至少為5 個數(shù) 量級.

6.   本產(chǎn)品足夠 50  20μL 體系的染料法熒光定量 PCR 反應(yīng).


7.   本產(chǎn)品只能用于科研.

成分規(guī)格

 

產(chǎn)品組成

編號

規(guī)格

2 ×SYBR qPCR Mix

GZ020801

550 μL

DEPC-H2O

GZ070401

1 mL

熒光模板稀釋液

GZ070407

1 mL

單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 引物 混合液

 

GZ1464110yw

 

260 μL

單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 陽性

對照(1×10E8  拷貝/μL)

 

GZ1464110pc

 

50 μL

保存條件

低溫運輸,-20保存,保存期限為一年.陽性對照需要單獨放置,不要污染其他試 劑. 使用方法

DNA 提取(樣本制備區(qū))

1.  (選做)如果有 N 個樣品待提取,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的是 PC(樣品制 備陽性對照)和 NC(樣品制備陰性對照).可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液 10μL 再加 上一定量的水,使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致,以此作為 PC .另外用水作為  NC.

2.  用自選方法提取純化樣品 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容. 建議使用病毒基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA.

二 稀釋標準曲線樣品(樣本制備區(qū))

(由于陽性對照濃度高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,避免污染樣 品或本試劑盒的其他成分).

1.    標記 6 個離心管,分別為 7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2.

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液,(最好用帶芯槍頭,下同).

3.     7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL  的陽性對照(試劑盒提供) ,充分震蕩 1 分鐘,  1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品.放冰上待用.

4.    換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得) ,充分震  1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品.放冰上待用.

5.    換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得) ,充分震  1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品.放冰上待用.

6.    重復(fù)上面的操作直到得到6 個稀釋度的標準曲線樣品.放冰上待用. 若無需制作標準曲線,將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可.

三 試劑配制(試劑準備區(qū))

向各 qPCR 管中分別加入下列成分.

 

成分

N 

待檢樣品管

qPCR    陰性對照

qPCR    陽性對照

2 ×SYBR qPCR Mix

 10 μL

10 μL

10 μL

50× ROX Reference Dye I or II (用戶自備)

 0.4 μL

0.4 μL

0.4 μL

單純皰疹病毒 1 型染料法 qPCR 引物 混合液

 4.6μL

4.6μL

4.6μL

注:需使用 ROX Reference Dye I 的機型:ABI Prism5700  7000  7300  7700  7900  7900HT 7900HT Fast  Step-One  Step-One Plus.

需使用 ROX Reference Dye II 的機型:ABI Prism 7500/7500Fast  ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P.

不需要使用ROX 的機型:Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4; Cepheid SmartCycler; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche

Applied Science LightCycler 480; Thermo Scientific PikoReal Cycler .(用 DEPC- H2O 補足即可)

轉(zhuǎn)移至模板添加區(qū).

四 添加模板(模板添加區(qū))

 qPCR 管中分別加入 5 μL 模板,加樣順序為陰性對照DEPC-H2O) 待測樣品模 板 單純皰疹病毒 1  qPCR 陽性對照,離心 30 秒,立即進行擴增反應(yīng).

五 擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū))

 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置,進行擴增,擴增程序如下:

 

過程

溫度

時間

預(yù)變性

95

3 min

qPCR 反應(yīng)  45 個循環(huán))

95

30 sec

60

30 secSYBR 通道采集熒光信號)

按儀器預(yù)設(shè)程序進行熔解曲線分析

六 結(jié)果分析

1.  如果制作標準曲線,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標 準曲線.再以待測樣品的 Ct值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,推算出其濃 度.

2.  如果未制作標準曲線,按照如下標準判定結(jié)果:

陽性對照(1×10E5 拷貝/μL)結(jié)果:Ct <30,有明顯指數(shù)增長,呈典型的 S 型曲線. 陰性對照結(jié)果:Ct >40 或無 Ct值,無明顯指數(shù)增長期和平臺期.

樣本檢測結(jié)果:Ct <38 ,有明顯指數(shù)增長,表明樣本中檢測出單純皰疹病毒 1 型, 結(jié)果為陽性;Ct >40 或無 Ct值,表明樣本中未檢測出單純皰疹病毒 1 型,結(jié)果為陰性; Ct 值在 38-40 范圍,應(yīng)對樣本進行復(fù)檢,如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct值仍在 38-40 范圍,熔解曲 線的峰值與陽性對照相同,則該樣本判斷為陽性;若不相同,熔解 Tm值與目的擴增片段 Tm 值相差≥2 , 則為非特異性擴增,該樣本判斷為陰性.


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