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發(fā)布時間：2024/11/19 9:25:21 閱讀次數(shù)：117
| 傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 凍存條件 | 細胞庫無血清凍存液 |
| 細胞描述 | 組織來源：前列腺 疾�。合侔� 性別：雄性 年齡：32周 培養(yǎng)體系：該細胞系培養(yǎng)所用基本培養(yǎng)基為 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM),配置完全培養(yǎng)基時需加入 5ug/ML bovine insulin,10 nM dehydroisoandrosterone,10%FBS, 1%Anti-Anti. 本庫的細胞僅用于科研工作,未經(jīng)許可不得用于其他目的,使用者不得將本庫細胞轉(zhuǎn)讓給第三者. | ||
| 培養(yǎng)備注 | 該細胞系培養(yǎng)所用基本培養(yǎng)基為高糖DMEM, 配置完全培養(yǎng)基時需加入 10%FBS,10ug/ml Insulin,1% Anti-Anti | ||
細胞收到后處理
培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法.收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶,消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴格無菌操作,將細胞瓶放入37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認收到狀態(tài)良好.（換液后將瓶蓋擰松）
細胞培養(yǎng)步驟
a 細胞傳代：如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%,即可進行傳代培養(yǎng).
貼壁細胞傳代步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣 鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次.
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化.
3.輕輕吹打細胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸.
4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
懸浮細胞傳代步驟日下：
1 半換液法
半換液處理,豎著培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱靜置1小時左右,輕輕吸掉3ml左右培養(yǎng)基,然后補給3ml的完全培養(yǎng)基,如果培養(yǎng)基變色慢,可直接加500ul左右FBS,傳代的時候可以直接補給5ml培養(yǎng)基 分兩個培養(yǎng)瓶培養(yǎng),一般這樣傳代3次左右可以離心傳代一次,去掉死細胞.
2 離心換液法
如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中1000rpm,離心5min,棄去上清,補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行.
b 細胞凍存：
1 細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞一次；
2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；
3 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,混勻后加入凍存管中.
4 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中.
C 細胞復(fù)蘇：
1 從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2 將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；
3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).
注意事項：有些細胞貼壁不牢,在運輸過程中容易發(fā)生細胞脫落,這是正�，F(xiàn)象.如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
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