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大鼠海馬神經(jīng)元細胞H19-7

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大鼠海馬神經(jīng)元細胞H19-7

培養(yǎng)說明書

一、細胞培養(yǎng)條件

細胞名稱

大鼠海馬神經(jīng)元細胞H19-7

生長特性

貼壁生長

凍存條件

無血清凍存液(貨號:C7001)

培養(yǎng)體系

DMEM+10%FBS+1%雙抗

傳代方法

第一次建議1:2傳代 

傳代情況

2天換液

備注

用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基,留作過渡對比培養(yǎng)

如果對比培養(yǎng)效果不好,建議直接購買我們的完全培養(yǎng)基

二、細胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞,消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作將細胞瓶放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存(最好40x,100x,200x各一張),前三天照片重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基,另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基,以便進行對比培養(yǎng),換液后將蓋子擰松

三、細胞培養(yǎng)步驟

a、細胞傳代如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng);如果細胞密度80%,即可進行傳代培養(yǎng),傳代具體步驟如下:

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 添加1-2ml消化液0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL完全培養(yǎng)重懸。

4. 將細胞懸液按1:2的比例進行分瓶傳代(兩個T25瓶),補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

b、細胞凍存:

1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞一次;

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;

3、 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),混勻后加入凍存管中。

4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,需在-80℃冰箱 存放24小時以上轉(zhuǎn)入液氮罐中。

C、細胞復(fù)蘇:

1、從液氮中取出細胞凍存管(注意佩戴防護面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;

2、將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;

3、棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種T25培養(yǎng)瓶,37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

4、第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

四、注意事項:有些細胞貼壁不牢,在運輸過程中容易發(fā)生細胞脫落,這是正,F(xiàn)象。可按此方法:將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)(后期對比培養(yǎng)),沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代(兩個T25),補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

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