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藍(lán)舌病病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒

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【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,定性檢測藍(lán)舌病病毒,對藍(lán)舌病病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對藍(lán)舌病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含藍(lán)舌病病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號

組成

50T/

1

 RT-PCR反應(yīng)液

750 μL×1

2

逆轉(zhuǎn)錄酶

100 μL×1

3

Taq

150 μL×1

4

陽性對照

 40 μL×1

5

陰性對照

 40 μL×1

6

說明書

1

注:陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,陽性對照為失去活性的藍(lán)舌病病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標(biāo)本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標(biāo)本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T+陽性對照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)

RT-PCR反應(yīng)液

15.0 μL

逆轉(zhuǎn)錄酶

 2.0 μL

Taq

 3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCRPCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集藍(lán)舌病病毒熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

    42℃10分鐘(min

1

預(yù)變性

95℃3分鐘(min

1

預(yù)擴(kuò)增

95℃5秒(s

5

55℃40秒(s

PCR擴(kuò)增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 1)陽性對照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct≤35。

 2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長期。

2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

陽性(+)

標(biāo)本中檢出藍(lán)舌病病毒RNA

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出藍(lán)舌病病毒RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV≤5%。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,不能混用;實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作;三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時(shí)離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。

 

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