| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 施馬倫貝格病毒（Schmallenberg Virus，SBV）是一種RNA病毒，是一種正本雅病毒屬的新病毒，感染癥狀為發(fā)熱、腹瀉、乏力等，感染此病毒的奶牛產(chǎn)奶量降低，以及新生幼畜出現(xiàn)缺陷等。目前還沒有發(fā)現(xiàn)它能感染人的證據(jù)，因此快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，本產(chǎn)品以探針?lè)晒舛?RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)施馬倫貝格病毒的試劑盒。 它具有下列特點(diǎn)： 1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。 2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高。 3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。 4. 特異性高，引物是根據(jù)施馬倫貝格病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。 5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?RT-PCR 反應(yīng)。 6. 本產(chǎn)品只能用于科研。 | ||
| 規(guī)格及成分 | 成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| 探針?lè)?/span>qRT-PCR緩沖液 | 190504a | 500 μL（藍(lán)蓋） | |
| 探針?lè)?/span>qRT-PCR酶混合液 | 190504b | 100 μL（紅蓋） | |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | |
| 施馬倫貝格病毒探針?lè)╭RT-PCR 引物混合液 | 15-90300yw | 100 μL（白蓋） | |
| 施馬倫貝格病毒qRT-PCR 探針 | 15-90300pb | 50 μL（棕色管） | |
| 施馬倫貝格病毒探針?lè)?/span>qPCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL) | 60908-90300pc | 50 μL（黃蓋） | |
| 使用手冊(cè) | 15-90300sc | 1 份 | |
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。 | ||
| 自備試劑 | 樣品 RNA。 | ||
| 使用方法 | 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。 2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。 3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 | ||
| | 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E6 拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用 5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入5μL 1×10E6 拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用 6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 RNA 的制備 7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢杂� 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。 8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA 提取試劑盒兼容。也可以向我公司購(gòu)買柱式病毒RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行） 9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后最后加） | |||
| 成分 | 樣品管 N+2 個(gè) | PCR 陰性 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） | |
| 探針?lè)?/span>qRT-PCR緩沖液 | 各10μL | 10μL | 各10μL | |
| 探針?lè)?/span>qRT-PCR酶混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL | |
| 施馬倫貝格病毒 qPCR 探針 | 各1μL | 1 μL | 各1μL | |
| 施馬倫貝格病毒探針?lè)?qPCR 引物混合液 | 各2μL | 2 μL | 各2μL | |
| 待測(cè)樣本 RNA 模板 | 5 μL | - | - | |
| | 超純水 | - | 5 μL | - | |||||||||||||
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7 號(hào)） |
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- | 各5μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…） | ||||||||||||||
| 11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：
四、數(shù)據(jù)處理 12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。 4. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于35，則為陽(yáng)性。 | |||||||||||||||||
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | 施馬倫貝格病毒可視化 LAMP 檢測(cè)試劑盒 | ||||||||||||||||
