柱式大RNA-miRNA雙提試劑盒 是 在基 因 在 柱式 RNA 提取 產(chǎn) 品基 礎(chǔ) 上自 主開 發(fā)的 大RNA-miRNA 雙提產(chǎn)品。它具有下列特點：
1. 一款試劑盒兩用，同時分離純化大 RNA（mRNA、18S rRNA、28SrRNA）和 miRNA（5S rRNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等）。
2. 柱式連貫操作，比市場上的兩步法（先分離總 RNA 再從中純化其中的miRNA）更簡單快捷。
3. 適用范圍廣，可以用于動物組織、血液及部分植物組織等實驗材料。
4. RNA 純凈，OD260/280 一般都在 1.9 以上。
5. 可用于 RT-PCR、miRNA 標(biāo)記、microarray 等各種后續(xù)實驗。
柱式大RNA-miRNA雙提試劑盒 使用方法;
下列操作是從 100mg 樣品中同時提取大 RNA 和 miRNA 的操作。如果只需要大 RNA 或 miRNA，則不相關(guān)操作可以跳過。
一、通用步驟
1. 新鮮配制裂解液。將溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合得裂解液，然后根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：溶液 A 和溶液 B混合后必須立即使用，不要放置，否則會產(chǎn)生沉淀。
a) 對貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1 mL 新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。
b) 對懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每 1-5×10E6 懸浮細(xì)胞中加入 1 mL 新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。如果是 fibroblasts 或 carcinoma cell，1 mL 新鮮配制的裂解液的細(xì)胞使用量不要超過 1×10E6 個細(xì)胞。
c) 對新鮮的動物組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10mL 或 15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿 30 秒左右。對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用量不要超過50 mg/ mL 裂解液，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。d) 對新鮮的植物組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10mL 或 15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿 30 秒左右。
e) 對非凍型組織 RNA 保存液保存的動物或植物組織：先用紙吸去保存液后再剪切成小塊，放入 10 mL-15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 新鮮配制的裂解液，用勻漿器勻漿 30 秒左右。
2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，然后加入 0.2 倍體積的自備氯仿(1 mL 裂解物需 0.2 ml 氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。
3. 14000 g 室溫離心 5 分鐘。
4. 將上層水相（約 0.6-0.8 mL）轉(zhuǎn)移到一個寬口離心吸附柱中以吸附大RNA。注意：當(dāng)樣品的比重大時，可能上層是有機相，下層才是水相。兩相之間含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 染。
5. 14000 g 室溫離心半分鐘，大 RNA 將與寬口離心吸附柱的膜結(jié)合，miRNA 將存在于穿透液中。注意：由于離心吸附柱的最大吸附能力為 40ug 動物 RNA，20 ug 植物 RNA，如果樣品中的大 RNA 含量高于上面數(shù)
值，則大 RNA 也會進入穿透液，因此不要超載。
二、大 RNA 提取步驟
6. 加 0.7mL 通用洗柱液到寬口離心吸附柱中，14000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。
7. 再加 0.3mL 通用洗柱液到寬口離心吸附柱中，14000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。
8. 14000 g 室溫離心半分鐘以甩出殘留液體。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響大 RNA 的使用。
9. 將寬口離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一干凈的 RNase-free 離心管中，加入 50uLRNA 洗脫液。
10. 14000 g 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為大 RNA 樣品，可以立即使用（電泳、測 OD，RT-PCR 等）或存放于-80℃待用。
三、miRNA 提取操作
11. 在第 5 步所得的穿透液中加等體積的溶液 C，所得混合液總體積約為 1.5mL），顛倒混勻。
12. 先轉(zhuǎn)移 0.7mL 混合液到一窄口離心吸附柱中，室溫靜置 5 分鐘。
13. 14000g 室溫離心半分鐘。注意：由于 miRNA 太短，掛膜效率較低，因此大約有 30%左右的 miRNA 還在穿透液中，如果需要回收這些 miRNA，
可以將收集管中的穿透液轉(zhuǎn)移到一新離心管中保存，稍后按附錄的沉淀法進一步回收。如果不需要則棄之。
14. 再轉(zhuǎn)移 0.7mL 混合液到窄口離心吸附柱中，室溫靜置 5 分鐘。
15. 14000 g 室溫離心半分鐘。將收集管中的穿透液和上步所得的穿透液匯集，（如果需要回收其中的 miRNA）或棄之（如果不需要回收其中的miRNA）
16. 加 0.7mL miRNA 專用洗柱液到窄口離心吸附柱中，14000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。
17. 再加 0.3mL miRNA 專用洗柱液到同一窄口離心吸附柱中，14000 g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。
18. 14000 g 室溫離心半分鐘以甩出殘留液體。此步十分重要，否則殘留的miRNA 專用洗柱液會影響 miRNA 的使用。
19. 將窄口離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一干凈的 RNase-free 離心管中，加入 30uLRNA 洗脫液。
20. 14000 g 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 miRNA 樣品，可以立即使用（電泳、測 OD，RT-PCR 等）或存放于-80℃待用。
柱式大RNA-miRNA雙提試劑盒 附錄 1：從第 15 步所得穿透液中用沉淀法回收殘留的 miRNA
21. 將穿透液在 14000 g 室溫離心 20-30 分鐘。
22. 小心吸棄上清。注意不要碰及管內(nèi)的離心面，miRNA 將在此面形成沉淀。
23. 加入 1mL 自備的 75%乙醇，14000 g 室溫離心 5 分鐘。。
24. 小心吸棄上清。注意不要碰及管內(nèi)的離心面。
25. 14000 g 室溫離心半分鐘，小心吸棄殘留液體，不要碰及管內(nèi)的離心面。
26. 加入 20uL RNA 洗脫液吹打溶解管底和管壁的 miRNA 沉淀。所得溶液
即為 miRNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。柱式大RNA-miRNA雙提試劑盒
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