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柱式動(dòng)物線粒體 DNAOUT,PCR 級(jí)

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柱式動(dòng)物線粒體 DNAOUT,PCR 級(jí) 是進(jìn)行分子進(jìn)化研究和母性遺傳研究的重要材料,但傳統(tǒng)的兩步式 mtDNA 提取方法是先溫和裂解細(xì)胞,分離線粒體,然后再?gòu)?/p>

線粒體中提取 mtDNA。此方法中的溫和裂解細(xì)胞的條件十分難以控制,需要針對(duì)不同組織材料單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化。本方法克服了上述缺點(diǎn),具有下列優(yōu)點(diǎn):
1. 不需要單獨(dú)純化線粒體,柱式法純化,操作簡(jiǎn)單快捷。
2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。
3. 每 107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克組織一般能得到 3-5 ug mtDNA。
4. 注意:本產(chǎn)品只適合于動(dòng)物材料,不適合于植物材料,因?yàn)橹参锞粒體 DNA一般都十分巨大,非常難提。
 
一:培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理
1. 用自備的 0.25%胰酶消化液處理約 107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞,離心收集后棄上清。
2. 用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA 提取。
二:組織細(xì)胞預(yù)處理
3. 用剪刀將 1g 新鮮的動(dòng)物組織剪碎(芝麻大小最好),轉(zhuǎn)移到 1.5mL 塑料離心管中,用于 mtDNA 提取。注意:最好不要使用凍存的動(dòng)物組織,因
為凍凝過(guò)程中形成的冰晶會(huì)將線粒體刺破,使其 DNA 釋放出來(lái)被胞漿中的 DNA 酶降解,影響回收率。
三:血液預(yù)處理
4. 將 3-5 mL 抗凝外周血靜置 30 分鐘或低速離心 5 分鐘,取白細(xì)胞層。
5. 用自備 PBS 洗滌白細(xì)胞兩次,得到的白細(xì)胞沉淀用于 mtDNA 提取。四:mtDNA 提取
5. 在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入 250 uL 冰浴的溶液 A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入 250 uL 常溫的溶液 B(如果溶液 B 有沉淀,用前須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻 10 次。千萬(wàn)不要?jiǎng)×艺袷帯?/div>
7. 冰上放置 6-8 分鐘。注意不要超過(guò) 8 分鐘。
8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C,溫和混勻 4-6 次,可見(jiàn)白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置 20-25 分鐘。
9. 室溫 12000-15000 g 離心 10 分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大,有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正,F(xiàn)象,取上清時(shí)避開(kāi)漂浮的沉淀即可。
10. 靜置 5 分鐘以讓 DNA 與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
11. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入 500 uL 的通用洗柱液,室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,棄收集管中廢液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會(huì)揮發(fā)。
13. 重復(fù)上步 1 次。
14. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會(huì)影響 DNA 的后續(xù)使用(如 DNA 上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 mL 塑料離心管中,加入 30-50 uL65-80℃預(yù)熱的 DNA 洗脫液,室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
16. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,離心管底溶液即 mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合 DNA 能力較強(qiáng),如果再加 30-50 uL DNA 洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多 mtDNA(相當(dāng)于第一次洗脫的 20-30%),但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液來(lái)洗脫。
18. 12000-15000 g 離心 1 分鐘,離心管底溶液即線粒體 DNA。每 107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克組織一般能得到 3-5 ugmtDNA。如果 DNA 需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于 DNA 機(jī)械斷裂,電泳時(shí) DNA 可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此 mtDNA 溶液可以直接用于 PCR。 線粒體線粒體是合成 ATP 和脂肪酸的細(xì)胞器,每個(gè)細(xì)胞有多個(gè)線粒體,每個(gè)線粒
體有多個(gè)線粒體基因組,例如每個(gè)釀酒酵母(S.cerevisiae)細(xì)胞里有 20 多個(gè)線粒體,人淋巴細(xì)胞有數(shù)個(gè),肝細(xì)胞有 500-2500 個(gè),卵母細(xì)胞有上千個(gè)。除少數(shù)低等真核生物線粒體基因組為線狀 DNA 外,其他生物的線粒體基因組都是環(huán)狀 DNA。線粒體基因組缺乏組蛋白,故無(wú)核小體。哺乳動(dòng)物的線粒體基因DNA 沒(méi)有內(nèi)含子,幾乎每一對(duì)核苷酸都參與一個(gè)基因的組成,有許多基因的序列是重疊的。不同物種的線粒體基因組的大小相差懸殊,在動(dòng)物中的趨勢(shì)是物種越高等,mtDNA 越小。常見(jiàn)物種 mtDNA 的大小列表:
 
人 mtDNA 只有 D 環(huán)區(qū)(D-loop,參與復(fù)制啟動(dòng))和另外 87 個(gè) bp 不是編碼基因外,其余序列共編碼 13 個(gè)蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素 b、細(xì)胞色素氧化酶的 3個(gè)亞基、ATP 酶的 2 個(gè)亞基以及 NADH 脫氫酶的 7 個(gè)亞基)、24 個(gè) rRNA(包括 1 個(gè) 16SrRNA、1 個(gè) 12SrRNA 和 22 個(gè) tRNA)。人類的神經(jīng)肌肉變性疾病如 Leber 氏遺傳性視神經(jīng)病、帕金森病、早老癡呆癥、線粒體腦肌病、母系遺傳的糖尿病和耳聾等都同線粒體基因有關(guān)。與細(xì)胞核 DNA 相比,mtDNA 具有下列特點(diǎn):①突變率高,是核 DNA 的 10-100 倍左右,有利于檢查出在較短時(shí)期內(nèi)基因發(fā)生的變化,有利于比較不同物種的相同基因之間的差別,確定這些物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系;②母性遺傳(maternal inheritance),這是由于動(dòng)物精子的細(xì)胞質(zhì)極少,子代 mtDNA 基本上都是來(lái)自卵細(xì)胞,因此具有相同 mtDNA 序列的個(gè)體必定是來(lái)自一位共同的雌性祖先。 
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