1. 純度高，不含污染和抑制劑，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis 等各種后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，不會(huì)發(fā)生離心柱堵塞現(xiàn)象。

2. 產(chǎn)率一般在 1-2 ug/1 g 葉片樣品。OD260/280 一般在 1.8 以上。DNA 片段長(zhǎng)度一般在 40-50 Kb 左右。

3. 本產(chǎn)品足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片。

已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等雙子葉植物，也適用于單子葉等其他植物（可能需要優(yōu)化條件）。

注意：葉綠體對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是rpm 計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。強(qiáng)烈建議用顯微鏡監(jiān)控整個(gè)過(guò)程中葉綠體的回收情況。

一：葉綠體的純化

1.實(shí)驗(yàn)前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離

心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤(rùn)，即使如此，葉片的放置時(shí)間也不能超過(guò)一天。

2. 計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需葉綠體勻漿液的體積（下面簡(jiǎn)稱勻漿液），本試劑盒一次實(shí)驗(yàn)可處理 30 g 葉片，對(duì)一般植物，每克葉片需要準(zhǔn)備 4 mL 勻漿液，則一次實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備 120mL 勻漿液。對(duì)煙草和大豆，每克葉片需要 6 mL 勻漿液， 則一次實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備 180mL 勻漿液。為了保險(xiǎn)可以多配 10%。

3. 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備勻漿液。制備方法是：將自備的去離子水與試劑盒提供的勻漿液成分一在干凈的玻璃或塑料容器中按 4：1 的比例混合，然后在每 100 mL 混合液中加入勻漿液成分二干粉 0.1g（終濃度為 0.1%），輕柔攪拌 10 分鐘后，所得溶液即為勻漿液。冰上預(yù)冷待用。勻漿液只能當(dāng)天使用，不能放置。

4. 預(yù)留 1.5mL 用于懸浮葉綠體，其余勻漿液轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中，再快速將新鮮植物葉片的葉脈去除，再將葉片剪成1-3 cm2 大小的碎片，浸泡在勻漿機(jī)里面的勻漿液中。

5. 低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的葉碎片按入到勻漿機(jī)底部， 再低速勻漿 10 秒。注意：還可用 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等勻漿，但它們單次處理量小，需分成很多份處理后再匯集，非常不方便。

6. 用帶柄尼龍濾膜過(guò)濾勻漿液，用預(yù)冷的 200 mL 量筒收集穿透液，再等分到4 個(gè)預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個(gè)管中的穿透液不要超過(guò) 35 mL）。帶柄尼龍濾膜洗滌干凈后可反復(fù)使用。

7. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對(duì)菠菜，白菜和萵筍材料）或400 g 離心 1 分鐘（對(duì)甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。其他植物材料則需要用戶自己摸索最佳離心力。

8. 將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。

9. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體。

10. 在沉淀中加入 1.5 mL 預(yù)冷的勻漿液，手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意： 重懸時(shí)最好避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。沉淀下有白色淀粉屬于正�，F(xiàn)象，但重懸葉綠體時(shí)避免將白色淀粉重懸。

11. 將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL），得到葉綠體粗提液。

12. 如果對(duì)葉綠體 DNA 是否含細(xì)胞核 DNA 的要求不高，則葉綠體粗提液可以直

接用于葉綠體 DNA 純化，具體操作是在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀為葉綠體，直接用于 DNA 純化（見(jiàn)步驟二）。

13. 如果需要無(wú)細(xì)胞核 DNA 污染的葉綠體 DNA，則按以下流程操作：在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 勻漿液成分一和 4 mL 的 Percoll，充分混合均勻得到 40%的 Percoll 溶液，在其液面上小心鋪上 6mL 的葉綠體粗提液，在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 6 分鐘，管底綠色沉淀為完整的葉綠體， 液面的綠色部分為破碎的葉綠體。小心將上清去除后，直接將沉淀（完整葉綠體）用于葉綠體 DNA 純化（見(jiàn)步驟二）。

二：葉綠體 DNA 的純化（溶液A 和溶液B 容易產(chǎn)生沉淀，溶液 B 十分粘稠，均

需 65℃溶解并搖勻后待用）

14. 將 600 uL 預(yù)熱的溶液 A 加入到葉綠體沉淀中后充分吹打混勻。

15. 加入 300 uL 預(yù)熱的溶液B，震蕩混勻 10-30 秒。注意：溶液 B 非常粘稠， 可以采取稱量方法稱取 300mg（約等于 300uL）使用或?qū)?/font> 1 mL 槍頭剪去一截后再吸取 300uL 使用。

16. 65℃放置 3-5 分鐘。如果室溫放置，DNA 產(chǎn)量會(huì)降低 10-20%。

17. 加入 200 uL 自備氯仿，震蕩混勻 10-30 秒。

18. 12,000 rpm 室溫離心 2 分鐘。此時(shí)上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液（約 0.8 mL）到一個(gè)新的 3-5 mL 離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。

19. 加入 1.5 倍體積(約 1.2 mL)的溶液 C，顛倒混勻后先轉(zhuǎn)移 0.7 mL 到離心吸附柱中，室溫放置至少 2 分鐘。12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，DNA 將吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。

20. 再將剩余的溶液按上步方法上柱。

21. 將 0.5 mL 通用洗柱液加入到吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，棄穿透液。重復(fù)操作一次�？账Π敕昼娙コ龤埩粢后w。

22. 將離心吸附柱放置在一新的 1.5 mL 塑料離心管中，加 50-100 uL DNA 洗脫液 2.0，室溫放置 3-5 分鐘。

23. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘即得植物葉綠體DNA 溶液，直接取 5-10 uL

電泳檢測(cè)，其余放冰箱備用。