產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本產(chǎn)品是類似于 TRIzol、基于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速總 RNA 提取試劑,可用于從各種動(dòng)物組織(包括白細(xì)胞)和部分植物材料中快速提取總 RNA。 1. 操作簡(jiǎn)單快速,只要 10 分鐘左右,可以全在室溫下進(jìn)行。 2. RNA 質(zhì)量高,OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以檢測(cè)到的基因組DNA 污染。 3. 適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料,如培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)物材料和少數(shù)植物材料。植物 RNA 的提取最好使用天澤基因的植物 RNAOUT。 4. 性價(jià)比高于進(jìn)口TRIzol 和 TRI Reagent 等同類產(chǎn)品。 | ||||
規(guī)格及成分 |
| 成 份 | 編 號(hào) | 小立盒包裝 |
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動(dòng)物 RNAout | 3070A | 100 mL(廣口棕色玻璃瓶) | |||
使用手冊(cè) | 3070sc | 1 份 | |||
運(yùn)輸及保存 | 常溫運(yùn)輸,4℃保存,有效期一年。 | ||||
自備試劑 | 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。 | ||||
使用方法 | 注意:下面的操作步驟是用 1 mL 本產(chǎn)品進(jìn)行的微量提取的,細(xì)胞使用量一定要準(zhǔn)確,不能超過(guò)下述用量,否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力,RNA 產(chǎn)量將急劇降低。如果樣品量大,請(qǐng)按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境最好用高效無(wú)毒的固相 RNase 清除劑(CAT#:3080)徹底處理。 1. 對(duì)貼壁細(xì)胞(10 平方厘米):吸盡培養(yǎng)液,加入 1 mL 的本產(chǎn)品用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解,然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離心管中,進(jìn)入第 6 步。 2. 對(duì)懸浮細(xì)胞(五百萬(wàn)至一千萬(wàn)個(gè)):離心收集細(xì)胞,吸盡液體,加入 1 mL 本產(chǎn)品,用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解,然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中,進(jìn)入第 6 步。 3. 對(duì)新鮮組織(50-100 mg):將新鮮組織剪切成小塊,放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中,加入 1 mL 的本產(chǎn)品,用 Polytron 剪切式勻漿器冰上勻漿 30 秒左右,將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 塑料離心管中, 進(jìn)入第 6 步。注意:對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織(細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA),使用量不要超過(guò) 30-50 mg,否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。對(duì) 10 mg 以下的組織,最好加入本公司的微量 RNA 助沉劑。 |
4. 對(duì) RNALOCKER 保存的組織(50-100 mg):先用紙吸去 RNALOCKER 液體后再剪切成小塊,其余操作同第 3 步。RNALOCKER 處理后的組織韌性很強(qiáng),勻漿時(shí)間需要適當(dāng)延長(zhǎng)。
5. 對(duì)液氮中保存的組織(50-100 mg):在研缽中研磨成粉,加入 1 mL
本產(chǎn)品,用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解,然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的
1.5 mL 塑料離心管中,進(jìn)入第 6 步。
6. 在裝有裂解物/勻漿物的 1.5 mL 塑料離心管中加入0.2 mL 自備氯仿, 振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。注意:一定要把官底的溶液震蕩起來(lái), 否則只是液面的振動(dòng)。
7. 13000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。
8. 將上清液(約 0.6 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。下層有機(jī)相(藍(lán)色)和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì),避免觸及,否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見(jiàn),可以留下 50-100uL 上清液不取。
9. 對(duì)脂類豐富的組織(如脂肪組織和腦組織),需再重復(fù)氯仿抽提一到兩次以讓氯仿充分去除脂類分子。
10. 在上清液中加入等體積的異丙醇,振蕩器上振蕩 30 秒混勻。
11. 13000-15000 g 室溫離心 5 分鐘,離心底的側(cè)面將形成 RNA 沉淀。如果組織使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率,可以將離心時(shí)間延長(zhǎng)到 20 或 30 分鐘。
12. 小心吸棄上清液,注意不要吸棄 RNA 沉淀。
13. 在含 RNA 沉淀的離心管中加入 1mL 75%乙醇,振蕩混勻 30 秒。
14. 13000-15000 g 室溫離心 1 分鐘。
15. 小心吸棄上清液,注意不要吸棄 RNA 沉淀。
16. 重復(fù)第 13-15 的洗滌步驟一次(也可以省略)。
17. 短暫快速離心,用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約 50 uL)。注意不要吸棄 RNA 沉淀。此步十分重要,否則殘留的乙醇會(huì)影響RNA 的后續(xù)使用。
18. 室溫放 1-2 分鐘后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使RNA 沉淀溶解。千萬(wàn)不要用真空離心法使 RNA 沉淀過(guò)于干燥,否則 RNA 將變得十分難溶。RNA 樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。
注意:由于 RNase-free 水沒(méi)有主動(dòng)滅活殘留 RNase 的功能,而任何方法提取的 RNA 都可能有殘留的 RNase,所以強(qiáng)烈建議客戶使用本公司推出的具有主動(dòng)滅活殘留 RNase 功能的、同時(shí)跟后續(xù) RT-PCR 等反
| 應(yīng)兼容的液相 RNase 清除劑(CAT#:3091)。 附一:RNA 完整性的電泳檢測(cè)(僅供參考,本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑) 如果需要做 Northern 雜交,強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳,因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子(BioTechniques,28: 414,2000)。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè),可以使用 TAE 緩沖液或超快核酸電泳液進(jìn)行常規(guī)電泳, 但文獻(xiàn)報(bào)道必須使用 RNAon 這樣的變性上樣液 (BioTechniques,9:558,1990)。普通 DNA 上樣液不含變性劑,也沒(méi)經(jīng)過(guò)去 RNase 處理,所以最好不要使用,否則 RNA 容易降解。 動(dòng)物 RNA 電泳后應(yīng)該在 UV 下呈現(xiàn)三條清晰的 rRNA 帶,28S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度一般比 18S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng) 1.5-2.3 倍。如果這兩條 rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解(因?yàn)榇蟮?RNA 被酶降解的可能更大)。 跟動(dòng)物一樣,植物果實(shí)和種子的 RNA 一般有三條電泳帶,但植物葉片的 RNA 有四條或更多rRNA 帶,多余的 RNA 來(lái)源于葉綠體。 如果電泳發(fā)現(xiàn) RNA 樣品中有 DNA 污染(一般是使用過(guò)多樣品造成),可分別用天澤基因的非酶DNA 清除劑或 RNase-free DNase 清除。 附二:RNA 產(chǎn)量和純度測(cè)定(僅供參考,本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑) 用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 緩沖液將 5-10 μL RNA 稀釋 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 測(cè)光吸收,通過(guò)光吸收可以得出 RNA 濃度(1 OD260 的 RNA=40 μg/mL),進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量(濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。RNA 的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同,一般來(lái)說(shuō),代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA 的產(chǎn)率高,代謝不旺盛的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA 的產(chǎn)率低,下面是常見(jiàn)動(dòng)物組織 RNA 產(chǎn)率: 肌肉,胎盤和腦組織:1-2 μg RNA/mg 組織肝,胰和腎組織:5-10 μg RNA/mg 組織培養(yǎng)細(xì)胞:5-15 μg/10E6 細(xì)胞 RNA 的純度通過(guò) OD260/OD280 來(lái)確定,一般在 1.8-2.1 之間即算合格。但即使低于此范圍,一般也不會(huì)影響 RT-PCR 等反應(yīng)。 蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除,多糖污染可 以用天澤基因的多糖清除劑去除。 |
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | RNADOWN、、液相 RNase 清除劑、固相 RNase 清除劑 |