產(chǎn)品及特點規(guī)格及成分
即用型PCR 試劑盒 3.0是在本公司即用型PCR 試劑盒2.0 的基礎(chǔ)上改良而來,內(nèi)含Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR 增強劑、上樣染料(對A 型)等所有PCR 所需要的成分,具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點:,
1. 方便,用戶只需準(zhǔn)備模板和引物即可以進行PCR 實驗。
2. 產(chǎn)品為2×預(yù)配液,操作步驟已經(jīng)最大限度地簡化,能減少污染,降低實驗誤差。
3. 擴增效率和靈敏度更高。
4. 本產(chǎn)品 A 型含電泳染料,PCR 反應(yīng)液可直接上樣電泳,進一步簡化了操作。
5. 產(chǎn)物可直接用于T 載體克隆,不需要額外的加A 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品足夠50 次40 mL 體系的常規(guī)PCR。
7. 本產(chǎn)品只供科研使用。
本產(chǎn)品A 型(90805A)中直接加入了專用染料,PCR 后可以直接上樣電泳。
本產(chǎn)品B 型(90805B)中沒有加入專用染料,客戶需要加上樣液后才可上樣電泳。
即用型PCR 試劑盒低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。
DNA 模板、引物、超純水。
以30 mL 的標(biāo)準(zhǔn)PCR 反應(yīng)體系為例:在一干凈的PCR 管中,加入下列成分:
|
| 補水到 | 30 mL |
|
放入PCR 儀中進行PCR, 結(jié)束后取 5-10 mL 直接上樣電泳(對A 型產(chǎn)品,如果是 B型產(chǎn)品,則需要額外再加 DNA 上樣液后才能電泳), 紅色染料電泳速度相當(dāng)于 50 bp DNA 片段。
注意: 1. 如果反應(yīng)體系不是 30 mL,各成分需要等按比例增加或減少。 2. 如果 DNA 模板中有 PCR 不明抑制物(植物、土壤和血液等 DNA 樣品常含此類抑制物),可以在 PCR 體系中加入 1/10 的 PCR 抑制物清除劑(CAT#:60804, 30mL 體系中加 3mL),可能會對 PCR 有幫助。 | ||||
即用型PCR 試劑盒相關(guān)資料 |
PCR 反應(yīng)的影響因素 變性溫度與時間:模板變性溫度是決定PCR 反應(yīng)中雙鏈 DNA 解鏈的溫度,達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈 DNA 模板,PCR 也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全, DNA 雙鏈會很快復(fù)性,因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高,又會影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為 94℃ 20~30 秒,高溫時間應(yīng)盡量縮短,以保持耐熱 DNA 聚合酶的活力, 最高變性溫度不宜超過 95℃。 退火溫度與時間:退火溫度決定 PCR 特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強,但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合,DNA 擴增效率下降;溫度低產(chǎn)量高,但過低可造成引物與模板 錯配,非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在 45~68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度,可根據(jù)引物的(G+C)%含量進行推測,一般實驗中退火溫度比擴增引 物的熔解溫度 Tm 低 5℃,退火時間一般為 30~60 秒,足以使引物與模板之間完全結(jié)合,長時間退火沒有必要。 延伸溫度與時間:PCR 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70~75℃之間,延伸時間根據(jù)所用 聚合酶擴增速度和擴增片段大小設(shè)定,如同樣擴增 2 Kb 片段,若使用 Taq 酶只需 1 分鐘,使用 Pfu 酶則應(yīng)設(shè)定 2 分鐘以上。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn),時間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。 循環(huán)次數(shù):可根據(jù)模板 DNA 的量、擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素,設(shè) 定 20-40 個循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足,如果循環(huán)次數(shù)太多,錯配幾率會增加, 非特異性背景嚴(yán)重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。 酶量:50 μL 反應(yīng)體系可用 0.5-5 U 酶,酶量的選擇與模板DNA 的量,擴增片段大 小等有關(guān),酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng),而且可能增加突變的機率,尤其在進行高 保真擴增時,應(yīng)盡量減少酶量,但酶量過少時反應(yīng)性能下降。 |
| 模板:模板可以是單鏈 DNA,也可以是雙鏈 DNA,質(zhì)粒 DNA 的擴增效率略低于線狀 DNA。模板加量一般不需太多,不超過 1 μg 為宜,因為加量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如,使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,就需要適當(dāng)加大模板用量。 引物:引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸,最高不宜超過30個核苷酸,最佳 長度為20~24個核苷酸,如需插入酶切位點,應(yīng)在酶切位點5’端多加幾個堿基,有利 于酶切。引物的(G+C)%含量組成應(yīng)均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個 引物中(G+C)%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級結(jié)構(gòu),如發(fā)夾結(jié) 構(gòu)。兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補,特別是在引物3’端。如果可能,引物3’端最好富有GC,這樣退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好經(jīng)過色譜層析純化或PAGE純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-2 μM 左右,濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增,太低則擴增產(chǎn)物太少。 |
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | PCR Inhibitor Erasol (CAT#:60804)。即用型PCR 試劑盒 |