【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：乙型Victoria流感病毒（Bv）檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Detection Kit for Influenza B virus Victoria (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測乙型Victoria流感病毒，對Victoria流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對乙型Victoria流感病毒基因組高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含乙型Victoria、流感病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
| 1 | Bv RT-PCR反應液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
| 2 | Bv混合酶 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
| 3 | Bv陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 4 | Bv陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為人基因組DNA，陽性對照為失去活性的乙型流感Bv病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.樣品取鼻拭子、咽拭子和糞便標本，采集方法如下：
(1) 鼻拭子：將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入2-4 ml采樣液中，尾部棄去。
(2) 咽拭子：用棉簽擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，同樣將棉簽頭浸入2-4 ml采樣液中，尾部棄去。
(3) 糞便標本：采集1-10g糞便（或用塑料桿人造纖維頭的肛拭子兩支）放入含有10 ml PBS或生理鹽水無菌的50ml有螺旋蓋的塑料瓶內(nèi)，密封，4℃條件下立即送至有關(guān)實驗室。
2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。
4.應避免標本間交叉污染。
5.樣本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
| 單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 17.5μL |
| 混合酶液 | 2.5 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
根據(jù)需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽性對照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。
| 反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 Bv 熒光信號 |
| PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 反轉(zhuǎn)錄 | 50℃：10分鐘（min） | 1 | |
| 預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
| PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
| FAM | |
| 陰性（－） | 標本中未檢出Bv RNA |
| 陽性（＋） | 標本中檢測出Bv RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用
