EdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒( EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)使EdU被Alexa Fluor 488所標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測(cè)細(xì)胞增殖的試劑盒。

本試劑盒可以檢測(cè)到細(xì)胞或組織樣品中單個(gè)的增殖細(xì)胞，同時(shí)也可以對(duì)細(xì)胞或組織樣品總體的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行定量檢測(cè)。本試劑盒可以檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品，也可以檢測(cè)組織切片。
經(jīng)本試劑盒處理后，增殖的細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)非常明亮的綠色熒光，可以用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，也可以用于高內(nèi)涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)僅適用于細(xì)胞樣品，不適用于組織切片。
細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法是直接檢測(cè)細(xì)胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測(cè)DNA合成來檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法，如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測(cè)的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時(shí)會(huì)和其它目的蛋白基于抗體的檢測(cè)相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點(diǎn)擊反應(yīng)，無需使用抗體、操作便捷、檢測(cè)靈敏度高，是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級(jí)換代的新方法，將會(huì)逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細(xì)胞活性的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，能檢測(cè)到細(xì)胞的總體增殖效果，但無法檢測(cè)到單個(gè)的增殖細(xì)胞。這幾種方法盡管都不是檢測(cè)DNA合成的，但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細(xì)胞熒光示蹤的原理能檢測(cè)到單個(gè)的增殖細(xì)胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細(xì)胞，檢測(cè)靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)，上述這些基于細(xì)胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補(bǔ)充性檢測(cè)方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通過一價(jià)銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)，其反應(yīng)原理參見圖1。通過點(diǎn)擊反應(yīng)，新合成的DNA會(huì)被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記，從而可以使用適當(dāng)?shù)臒晒鈾z測(cè)設(shè)備檢測(cè)到增殖的細(xì)胞。

圖1.  EdU檢測(cè)法中的點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。熒光探針等標(biāo)記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細(xì)胞DNA中的EdU，在銅離子的催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，最終使細(xì)胞DNA標(biāo)記上熒光探針或其它探針。

本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測(cè)靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點(diǎn)擊反應(yīng)，無需DNA變性，只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU，并且可以檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進(jìn)入細(xì)
胞并發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，不會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)，不會(huì)影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測(cè)，也不會(huì)影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測(cè)細(xì)胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進(jìn)入細(xì)胞并與DNA上的BrdU結(jié)合，需要對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測(cè)、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測(cè)原理的比較參見圖2。

圖2. BrdU法和 EdU法檢測(cè)原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體，由于空間位阻，雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標(biāo)記的疊氮化物(Azide)，無需DNA變性，操作更便捷，兼容性好，檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測(cè)快速，定性定量檢測(cè)都非常便捷。相對(duì)于至少需要4小時(shí)的BrdU法，本試劑盒采用的 EdU法檢測(cè)新合成的DNA只需1.5-2小時(shí)，時(shí)間上大大縮短。本試劑盒同時(shí)提供了染色細(xì)胞核的Hoechst 33342，以方便染色觀察所有的細(xì)胞
核�？梢允褂脽晒怙@微鏡或流式細(xì)胞儀等進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。HeLa細(xì)胞用本試劑盒和熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果參見圖3；Jurkat細(xì)胞用本試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果參見圖4。

圖3. HeLa細(xì)胞用本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果圖。無EdU組觀察不到綠色熒光(最左側(cè)一列)；EdU (10μM)孵育2小時(shí)組有明亮的綠色熒光(中間一列)；而用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)提前預(yù)處理0.5小時(shí)后，綠色熒光顯著減弱，說明DNA合成抑制后，EdU的摻入被顯著抑制(最右側(cè)一列)。

圖4. Jurkat細(xì)胞用本試劑盒標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖的效果圖。Jurkat細(xì)胞只用EdU標(biāo)記(左圖)，或在標(biāo)記的同時(shí)用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)處理(右圖)，2小時(shí)后用本試劑盒進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。從圖中可以看出，僅EdU標(biāo)記的細(xì)胞有較高比例的綠色熒光(488 fluorescence)陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色熒光陰性(弱染色)和陽性(強(qiáng)染
色)的兩個(gè)峰(左圖)，分別對(duì)應(yīng)于未增殖細(xì)胞和增殖細(xì)胞。經(jīng)過羥基脲處理的細(xì)胞，綠色熒光陽性的細(xì)胞幾乎完全消失(右圖)，僅剩下一個(gè)綠色熒光陰性的峰(右圖)。該檢測(cè)結(jié)果說明DNA合成被抑制后，EdU的摻入也被抑制。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞增殖情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本試劑盒小包裝C0071S如果用于培養(yǎng)的細(xì)胞(6孔板)的檢測(cè)，可以檢測(cè)50個(gè)樣品，每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液；如果用于96孔板檢測(cè)，可以檢測(cè)500個(gè)樣品，每個(gè)樣品的檢測(cè)體系為50μl的Click反應(yīng)液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測(cè)，分別可以檢測(cè)125、250、350和1250個(gè)樣品，每個(gè)樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以檢測(cè)50個(gè)樣品，每個(gè)細(xì)胞樣品的細(xì)胞數(shù)量宜為10-100萬，每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測(cè)，可以檢測(cè)125-250個(gè)樣品， 每個(gè)樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。大包裝C0071L可檢測(cè)樣品的數(shù)量為小包裝C0071S的4倍。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Azide 488和Hoechst 33342須避光保存。
注意事項(xiàng)：
Click Additive配制成溶液后請(qǐng)注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請(qǐng)上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請(qǐng)棄用。
如果需要使用羥基脲(Hydroxyurea)作為對(duì)照，可以從訂購(S1961 Hydroxyurea)。
如果用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要更多EdU，也可以從訂購(ST067 EdU)。
由于本產(chǎn)品需要銅離子催化進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，請(qǐng)注意如下的兼容性問題及解決方案。本產(chǎn)品完全兼容有機(jī)類染料如Alexa Fluor®系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；對(duì)于Qdot®納米晶體探針、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor® 680-R-PE等，需要在點(diǎn)擊反應(yīng)完成后進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)；本產(chǎn)品會(huì)影響GFP、RFP、mCherry等熒光蛋白的熒光，對(duì)于熒光類蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、
TC-FlAsH™和TC-ReAsH™類試劑，需要在點(diǎn)擊反應(yīng)前進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)。由于Phalloidin (鬼筆環(huán)肽)不兼容點(diǎn)擊反應(yīng)，推薦使用
Tubulin-Tracker Red (C1050)進(jìn)行細(xì)胞微管的檢測(cè)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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