冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測(cè)試劑盒(Coronavirus Mpro/3CLpro Activity Fluorometric Assay Kit)是一種用熒光法快速高靈敏檢測(cè)冠狀病毒主蛋白酶(main protease, 簡(jiǎn)稱Mpro，也稱3C-like protease，簡(jiǎn)稱3CLpro)活性的試劑盒。

2019年底由新型冠狀病毒引起的肺炎疫情，從2020年初開始在全球大流行，感染病例快速上升，引發(fā)全球關(guān)注。該病毒被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為2019-nCoV，被國(guó)際病毒分類委員會(huì)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠狀病毒導(dǎo)致的疾病，被世界衛(wèi)生組織正式命名為冠狀病毒疾病2019 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常稱為新型冠狀病毒肺炎，簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”。

新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于單正鏈的RNA病毒，與SARS-CoV以及MERS-CoV具有較高的同源性，該病毒感染進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞的幫助下，其遺傳物質(zhì)RNA的ORF1a/b首先翻譯表達(dá)出兩條多聚蛋白前體(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前體在主蛋白酶(main protease, 簡(jiǎn)稱Mpro)和木瓜樣蛋白酶(papain like proteases)的作用下發(fā)生分子內(nèi)的切割產(chǎn)生多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。Mpro也被稱為3C-like protease (3CLpro)，因?yàn)槠淝懈钗稽c(diǎn)的特異性與微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，兩者并稱為Mpro/3CLpro。多聚蛋白前體產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白參與了病毒亞基因RNA和四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的產(chǎn)生，進(jìn)而完成子代病毒的繁衍與釋放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至關(guān)重要的作用，且人體內(nèi)沒有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一個(gè)抗病毒藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)。

2019-nCoV Mpro/3CLpro與SARS-CoV Mpro/3CLpro只差12個(gè)氨基酸，同源性大于96%，兩者結(jié)構(gòu)基本一致，本試劑盒中使用的陽(yáng)性對(duì)照2019-nCoV Mpro/3CLpro是采用自主研發(fā)的PerfectProtein™蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)純化而來，使表達(dá)的重組2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白沒有任何額外的標(biāo)簽，沒有任何一個(gè)額外的氨基酸，確保與2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致，便于檢測(cè)體系的建立和酶活的比較。

冠狀病毒Mpro/3CLpro活性檢測(cè)試劑盒采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其檢測(cè)原理如下。MCA是熒光供體(Donor)，Dnp是熒光受體(Acceptor)或稱為淬滅基團(tuán)(Quencher)，這兩個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般7-10nm)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。MCA和Dnp被連接到Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物(Substrate)，即MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (P9731)的兩端。當(dāng)Mpro/3CLpro蛋白酶沒有切割該底物時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)足夠接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即Dnp可淬滅MCA熒光而檢測(cè)不到熒光；當(dāng)該底物被Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾兩端分離，兩個(gè)基團(tuán)分開，MCA熒光不再被Dnp淬滅，即可檢測(cè)到MCA熒光，這樣通過熒光檢測(cè)就可以非常靈敏地檢測(cè)Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。MCA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為325nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為393nm。本試劑盒的檢測(cè)原理請(qǐng)參考圖1。

圖1. 冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理圖。

本試劑盒內(nèi)提供了MCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，MCA標(biāo)準(zhǔn)品在0.2-50μM范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系�？梢酝ㄟ^設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中Mpro/3CLpro蛋白酶的活性。

本試劑盒可以檢測(cè)不同類型樣本的冠狀病毒Mpro/3CLpro酶活力，包括新冠病毒、含新冠病毒的細(xì)胞或動(dòng)物組織、表達(dá)Mpro/3CLpro酶的細(xì)胞或組織裂解液或純化的Mpro/3CLpro酶等。

用于96孔板檢測(cè)時(shí)，本試劑盒小包裝P0313S可以進(jìn)行100次檢測(cè)，本試劑盒中包裝P0313M可以進(jìn)行500次檢測(cè)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。其中P0313-3 Substrate和P0313-4 MCA Standard (10mM)需避光保存。

注意事項(xiàng)：

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需要完全解凍并平衡至室溫后再使用，否則可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)的使用應(yīng)在冰上進(jìn)行。使用完畢后各試劑應(yīng)立即按照試劑盒要求的條件保存。

請(qǐng)確保樣品pH值在7-8之間，或加入樣品后反應(yīng)體系的pH值在7-8之間，否則可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)值和穩(wěn)定性。

待測(cè)樣品裂解液是指裂解和稀釋待測(cè)樣品所用的裂解液，即病毒裂解液或含病毒的細(xì)胞、組織裂解液的稀釋液，該溶液可能會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，推薦用本試劑盒提供的Assay Buffer為溶劑稀釋待測(cè)樣品。體積較少的試劑首次使用時(shí)建議先離心數(shù)秒使液體沉降于管底，然后再使用。結(jié)凍的試劑必須完全融化并混勻后使用。

檢測(cè)時(shí)建議使用96孔黑板，推薦選購(gòu)BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.試劑盒的準(zhǔn)備：
融解Assay Buffer、Substrate和MCA Standard并平衡至室溫，輕輕混勻后Substrate和MCA Standard略離心使溶液積聚于管底。使用完畢后宜立即-20℃保存。
2.陽(yáng)性對(duì)照的準(zhǔn)備。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蛘邊⒖紙D2B取適量的2019-nCoV Mpro/3CLpro稀釋至一定的濃度。例如取1μl 2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml )，加入19μl Assay Buffer，混勻，即得50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro。反應(yīng)體系中若加入10μl 50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro，則2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白量為0.5μg。
3.MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混勻，即為200μl 100μM的MCA溶液，分別取0、0.5、1、2、4、6、8、10μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer補(bǔ)足至100μl，此時(shí)，MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的各孔MCA分別為0、0.5、1、2、4、6、8、10μM或0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1nmol。也可自行設(shè)置各孔MCA濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)定。
4.檢測(cè)體系的設(shè)置：
參照下表依次加入試劑盒各組分及樣品。初次檢測(cè)時(shí)，待測(cè)樣品可以稀釋一系列濃度梯度，確保最終檢測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)記為dil。

注1：待測(cè)樣品裂解液是指用于裂解和稀釋待測(cè)樣品所用的溶液，即病毒裂解液或含病毒的細(xì)胞、組織裂解液的稀釋液。
注2：為獲得更加可靠的檢測(cè)結(jié)果，推薦每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。
5.檢測(cè)：
a.振蕩混勻1-2分鐘，確�；旌铣浞�。
b.除MCA標(biāo)準(zhǔn)品孔外每孔加入2μl Substrate，混勻。注：加入Substrate后反應(yīng)會(huì)立即開始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時(shí)間差而導(dǎo)致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進(jìn)行。
c.混勻后立即使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測(cè)定。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀溫度為37℃，激發(fā)波長(zhǎng)為325nm，發(fā)射波長(zhǎng)為393nm。每1分鐘讀取一次數(shù)值。
注1：連續(xù)測(cè)定的時(shí)間可以根據(jù)待測(cè)樣品中Mpro/3CLpro的酶活性進(jìn)行調(diào)整，但是需確保獲得6個(gè)點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)。對(duì)于Mpro/3CLpro的酶活較高的樣品，建議測(cè)定總時(shí)間為5分鐘或10分鐘，對(duì)應(yīng)的測(cè)定間隔時(shí)間設(shè)為30秒或1分鐘；對(duì)于Mpro/3CLpro的酶活很低的樣品，可以延長(zhǎng)測(cè)定總時(shí)間為10、15或者20分鐘，對(duì)應(yīng)的測(cè)定間隔時(shí)間設(shè)為2、3或4分鐘。也可以連續(xù)測(cè)定20分鐘，每隔1分鐘測(cè)定1次。
注2：本試劑盒中的2019-nCoV Mpro/3CLpro活性較高，反應(yīng)較為迅速，約5分鐘已經(jīng)反應(yīng)完全。
注3：如果熒光酶標(biāo)儀沒有溫控功能，也可以在室溫測(cè)定，但這樣檢測(cè)出來的是室溫條件下的酶活性，此時(shí)酶活性可能會(huì)偏低一些，不同的酶偏低的程度會(huì)有所不同。
6.計(jì)算：
a.計(jì)算每個(gè)樣品孔和空白對(duì)照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對(duì)照、RFU陽(yáng)性對(duì)照和RFU待測(cè)樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。選取待測(cè)樣品組MCA熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系的時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用于分析，記錄呈線性關(guān)系的時(shí)間間隔為T，時(shí)間間隔T內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化量為ΔRFU，即ΔRFU= RFU待測(cè)樣品(Time b) - RFU待測(cè)樣品(Time a)。
b.也可以直接比較各個(gè)樣品在一定時(shí)間內(nèi)的ΔRFU而確定樣品的Mpro/3CLpro相對(duì)活性，但須確保最終時(shí)間點(diǎn)時(shí)RFU讀數(shù)未達(dá)平臺(tái)。
c.也可將標(biāo)準(zhǔn)曲線各孔的熒光值減去標(biāo)準(zhǔn)品零濃度孔的熒光值，建立MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔRFU代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可算出在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)樣品中MCA的生成量(記錄為A)。MCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)參考圖2A，MCA在0-1.3nmol范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。Mpro/3CLpro蛋白酶活性的計(jì)算公式如下：
Mpro/3CLpro Activity (nmol/min/ml或mU/ml)= A × dil/ (Vsample × T)
注：Vsample 為檢測(cè)時(shí)待測(cè)樣品的體積(Vsample=10μl=0.01ml)
dil為步驟4中稀釋倍數(shù)
T為步驟6a中反應(yīng)時(shí)間(min)
A為步驟6c中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得的MCA產(chǎn)物量(nmol)
酶活力單位U (Unit)的定義為：在pH7.0，溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1μmol MCA-AVLQ的酶量定義為一個(gè)單位。本試劑盒中提供的2019-nCoV Mpro/3CLpro的酶活力≥300U/g (即≥300μmol/min/g)。
圖2. 冠狀病毒Mpro/3CLpro活性熒光檢測(cè)試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)曲線和2019-nCoV Mpro/3CLpro陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)效果圖。本試劑盒的MCA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖見圖A。不同量的2019-nCoV Mpro/3CLpro酶切底物生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度示意圖見圖B。實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。​