Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium),也稱Heat-labile Bacterial UDG,即熱敏型細菌UDG,來源于嗜冷海洋細菌(psychrophilic marine bacterium) BMTU3346,可催化含尿嘧啶的DNA鏈中的尿嘧啶(dU)堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵發(fā)生水解,從而釋放游離尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的單鏈或雙鏈DNA,但不能水解RNA或含有dU的長度不超過6個堿基DNA寡聚體。
UDG主要應用于消除PCR擴增過程中帶來的產(chǎn)物污染問題。其防止污染的原理為:在PCR反應中加入適量的dUTP,以dUTP替代dTTP摻入DNA中,形成含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物;后續(xù)進行PCR反應時,使用UDG酶選擇性切割可能被污染而帶入的之前PCR擴增產(chǎn)生的含有dU的單鏈或雙鏈DNA,從而避免之前的PCR擴增產(chǎn)物可能的污染對于本次PCR擴增帶來的負面影響。
本產(chǎn)品為熱敏型,在50℃孵育10分鐘可以迅速不可逆滅活。在PCR或RT-PCR反應前,PCR或RT-PCR體系中加入Heat-labile Bacterium UDG室溫處理10min,即可充分消除可能的之前的含有dUTP的PCR擴增產(chǎn)物的污染。本產(chǎn)品不僅適用于PCR,也適用于qPCR、RT-PCR和qRT-PCR等體系。
活性定義:One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of [3H]-uracil in a 50 µl Standard Taq Reaction Buffer containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.
Heat-labile Bacterial UDG酶活性鑒定結果可參考圖1。
圖1.Heat-labile Bacterial UDG催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物效果圖。使用本產(chǎn)品或國外N公司的酶,在20µl體系,分別以5µl含dU堿基的PCR擴增1500bp PCR產(chǎn)物為底物和不同量的(0U, 0.0313U, 0.0625U, 0.125U, 0.25U, 0.5U) Heat-labile Bacterial UDG,在1X Heat-labile Bacterial UDG Buffer,37℃孵育30min,然后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖所示,本產(chǎn)品與N公司相比,具有相當?shù)拿富。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
Heat-labile Bacterial UDG經(jīng)滅活處理后酶活鑒定結果可參考圖2。
圖2.Heat-labile Bacterial UDG以及E. coli UDG (D7360)經(jīng)50℃10min處理后,催化酶解5µl含dU堿基的PCR擴增產(chǎn)物效果圖。將不同量的E. coli UDG (0U, 0.005U, 0.01U, 0.025U)和不同量的Heat-labile Bacterial UDG (0U, 0.0625U, 0.125U, 0.25U)經(jīng)50℃處理10min之后,在20µl體系,分別以5µl含dU堿基的PCR擴增1500bp PCR產(chǎn)物為底物,在1X Heat-labile Bacterial UDG Buffer,37℃孵育30min,然后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖所示,E. coli UDG 50℃處理10min之后酶活僅輕微下降,而Heat-labile Bacterial UDG均完全滅活。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
來源:大腸桿菌重組、表達和純化而獲得。
純度:不含UDG酶活力之外的內(nèi)切或外切脫氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。
用途:去除單鏈或雙鏈DNA尿嘧啶堿基;去除含dU的PCR產(chǎn)物氣溶膠污染;在二代測序(NGS)應用中,主要用于mRNA定向測序文庫的構建;用于提高定向誘變方法的效率和用來獲得高度標記的寡核苷酸探針;用于PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR體系。
酶儲存溶液:20mM Tris-HCl (pH 7.5), 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) glycerol。
10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer:100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3 at 25℃。
失活或抑制:50℃加熱10min可以使Heat-labile Bacterial UDG完全失活。
包裝清單:
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D7362S-1 | Heat-labile Bacterial UDG (1U/μl) | 100µl |
D7362S-2 | 10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer | 500µl |
— | 說明書 | 1份 |
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D7362M-1 | Heat-labile Bacterial UDG (1U/μl) | 500µl |
D7362M-2 | 10X Heat-labile Bacterial UDG Buffer | 2.5ml |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,至少一年有效。
注意事項:
Heat-labile Bacterial UDG酶在大多數(shù)PCR或RT-PCR體系中均具有活性,但對于自行使用的PCR或RT-PCR體系,首次使用時建議先測試一下是否和所使用的體系兼容。通常取含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物,參考圖1加入適量UDG,觀察能否有效降解含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物。本產(chǎn)品會被高離子強度(>100mM)所抑制。
dNTP/dUTP推薦選購D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。
Heat-labile Bacterial UDG酶對雙鏈DNA的活性低于對單鏈DNA的活性,對小的U-DNA寡核苷酸和dUMP有活性,但對RNA或正常的不含dUTP的DNA沒有活性。
Heat-labile Bacterial UDG酶活對于金屬離子沒有依賴性,在Mg2+或EDTA的存在情況下均具有活性。
由Heat-labile Bacterial UDG酶消化產(chǎn)生的DNA鏈的無堿基位點可通過加熱,堿處理或核酸內(nèi)切核酸酶處理而除去。通常PCR反應過程中的加熱步驟可以確保UDG酶消化的位點被完全剪切開。
Heat-labile Bacterial UDG酶可以在PCR反應前清除不慎污染的含dUTP的PCR產(chǎn)物,從而避免由于污染導致的PCR假陽性結果。
如果需要將Heat-labile Bacterial UDG酶應用于One-Step RT-PCR或者One-Step qRT-PCR體系,需要選擇耐熱反轉(zhuǎn)錄酶,并需要將逆轉(zhuǎn)錄溫度設置為50-55℃。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.按照常規(guī)反應體系設置PCR或RT-PCR反應體系,同時加入Heat-labile Bacterial UDG至最終濃度為0.02U/μl,混勻。通常僅加入PCR或RT-PCR的buffer即可,無需加入UDG的buffer。
2.25℃孵育5-10min (去除可能的含dUTP的PCR擴增產(chǎn)物的污染),隨后進入PCR或RT-PCR程序。