cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)，即First Strand cDNA Synthesis Kit(RNase H minus)是一種采用了經(jīng)過(guò)改造和優(yōu)化的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生
cDNA第一鏈的試劑盒。本試劑盒包含了進(jìn)行cDNA第一鏈合成所需的各種試劑。
采用本試劑盒可以合成長(zhǎng)達(dá)13kb的cDNA第一鏈。在采用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的情況下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA雙鏈復(fù)合物中的RNA不會(huì)被降解，這樣反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA的長(zhǎng)度就會(huì)更長(zhǎng)，并且產(chǎn)量更高。
試劑盒中提供了RNase Inhibitor，確保在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的RNA不會(huì)被RNA酶所降解并取得較好的反轉(zhuǎn)錄效果。
試劑盒還提供了Oligo(dT)18和random hexamer這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，后者進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。
試劑盒中提供的Control Primer為17聚，即引物的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基。試劑盒中提供的Control RNA為帶有3’poly(A)的
1.1kb RNA。
使用本試劑盒合成的第一鏈，可以直接用于后續(xù)的常規(guī)PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。
本試劑盒用于體積為20微升的cDNA第一鏈合成反應(yīng)時(shí)足夠進(jìn)行10個(gè)cDNA第一鏈樣品的合成。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7166-1 | M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)(200U/μl) | 2000U |
| D7166-2 | Reaction Buffer(5X) | 50μl |
| D7166-3 | RNase Inhibitor(20U/μl) | 10μl |
| D7166-4 | dNTP Mix(10mM each) | 20μl |
| D7166-5 | Oligo(dT)18 Primer(0.5μg/μl) | 10μl |
| D7166-6 | Random Hexamer Primer(0.2μg/μl) | 10μl |
| D7166-7 | Control RNA(20ng/μl) | 6μl |
| D7166-8 | Control Primer(5pmol/μl) | 6μl |
| D7166-9 | DEPC-treated Water | 0.2ml |
| － | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
對(duì)于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，試劑盒的使用說(shuō)明中給予了特別說(shuō)明，請(qǐng)予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. cDNA第一條鏈的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：
| 模板(后面4種任選一種) | Total RNA | 0.01-5μg |
| 或Poly(A) RNA/mRNA | 1-500ng | |
| 或Specific RNA | 0.01pg-500ng | |
| 或Control RNA | 2μl | |
| 引物(后面3種任選一種) | Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) | 1μl |
| Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) | 1μl | |
| Gene specific primer | 15-25pmol | |
| DEPC-treated Water | － | To 12μl* |
| 70℃孵育5分鐘，隨后立即放置到冰浴冷卻，4℃微離心，隨后加入下述試劑** | ||
| Reaction Buffer (5X) | － | 4μl |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | － | 1μl |
| dNTP Mix (10 mM each) | － | 2μl |
| MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-) | － | 1μl |
| 總體積 | 20μl | |
*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。
70℃孵育5分鐘并且隨后冰浴冷卻，這樣可以使RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開(kāi)。
b. 輕輕混勻(可以用Vortex在最低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)18作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用random hexamer(隨機(jī)六聚體)作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。
注意：對(duì)于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以設(shè)置為45℃孵育60分鐘。
d. 70℃孵育10分鐘以失活 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
說(shuō)明：對(duì)于長(zhǎng)片斷的cDNA不推薦采用加熱的方法失活M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，這種操作可能會(huì)導(dǎo)致部分長(zhǎng)片斷DNA被剪切。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR等反應(yīng)，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時(shí)，如果PCR的反應(yīng)體系為50微升，則推薦使用2微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 其他用途請(qǐng)自行參考M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行。
常見(jiàn)問(wèn)題：
1. RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，因此通常RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過(guò)PCR擴(kuò)增沒(méi)有特異性條帶。
PCR擴(kuò)增沒(méi)有獲得特異性條帶時(shí)建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看是否可以成功擴(kuò)增。如果可以成功，則說(shuō)明PCR擴(kuò)增體系沒(méi)有問(wèn)題，此時(shí)通常是目的基因的引物設(shè)計(jì)欠佳，當(dāng)然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地?cái)U(kuò)增，則有可能PCR體系存在問(wèn)題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
