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pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His

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pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His是研發(fā)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,用于表達(dá)C端帶有His標(biāo)簽(HHHHHHHH)人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme2,ACE2)的胞外N端肽酶結(jié)構(gòu)域(peptidase domain,PD) 1-615位的氨基酸所組成的蛋白,可以方便使抗His標(biāo)簽的抗體來(lái)識(shí)別ACE2(1-615)蛋白的表達(dá),免疫共沉淀分析或者蛋白純化等。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子,可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá),質(zhì)粒為氨芐青霉素抗性。

ACE2是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Rennin-angiotension system,RAS)的重要成員。血管緊張素(Angiotensin II,Ang II)是RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的作用。ACE2主要是通過(guò)降解血管緊張素II生成血管緊張素1-7(angiotensin-(1-7))從而發(fā)揮機(jī)體保護(hù)功能。ACE2是在肺、心臟、腎臟和腸中表達(dá)的I型膜蛋白,其胞外域包括N端肽酶結(jié)構(gòu)域(Peptidase domain,PD)及C端Collectrin-like結(jié)構(gòu)域(CLD)。ACE2是SARS冠狀病毒(SARS-CoV和SARS-CoV-2)和人類呼吸道冠狀病毒NL63的受體。SARS-CoV/SARS-CoV-2通過(guò)其Spike蛋白受體結(jié)合域(Receptor binding domain,RBD)與ACE2的肽酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合,參與病毒的感染過(guò)程。SARS-CoV-2 Spike蛋白與ACE2的親和力是SARS-CoV Spike蛋白與ACE2的親和力的10-20倍。

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His質(zhì)粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 232-819
T7 promoter and T7 primer binding site 863-882
Multiple cloning site 895-922
ACE2(1-615) 923-2767
His-tag 2768-2791
BGH pA 2838-3062
f1 origin of ss-DNA replication 3108-3536
SV40 promoter 3541-3884
Neomycin resistance ORF 3946-4740
SV40 polyA signal 4914-5044
pUC origin 5427-6097
Ampicillin resistance ORF 6242-7238
bla promoter 7137-7143

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His質(zhì)粒(7238bp)的圖譜如下:

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His的多克隆位點(diǎn)的詳細(xì)圖譜見(jiàn)說(shuō)明書:https://www.beyotime.com/Manual/D2951 pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His.pdf

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His)包括:

Acc65I G`GTAC,C 917 NruI TCG|CGA 208
AflII C`TTAA,G 908 PaeR7I C`TCGA,G 2795
ApaI G,GGCC`C 2811 PflFI GACN`N,NGTC 4192
AvrII C`CTAG,G 3864 PflMI CCAN,NNN`NTGG 1965
BamHI G`GATC,C 1992 PluTI G,GCGC`C 4077
BcgI ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` 6820 PshAI GACNN|NNGTC 2751
BmtI G,CTAG`C 899 PspOMI G`GGCC,C 2807
BsaBI GATNN|NNATC 3933 PspXI VC`TCGA,GB 2795
BssHII G`CGCG,C 4471 PvuI CG,AT`CG 6685
BstBI TT`CG,AA 4756 RsrII CG`GWC,CG 4590
BstZ17I GTA|TAC 5046 SacI G,AGCT`C 818
CspCI ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 626 SacII CC,GC`GG 1579
DraIII CAC,NNN`GTG 3341 SfoI GGC|GCC 4075
EagI C`GGCC,G 3980 SmaI CCC|GGG 3887
Eco53kI GAG|CTC 816 SnaBI TAC|GTA 590
EcoRI G`AATT,C 2722 SpeI A`CTAG,T 249
KasI G`GCGC,C 4073 TspMI C`CCGG,G 3885
KpnI G,GTAC`C 921 Tth111I GACN`N,NGTC 4192
MluI A`CGCG,T 228 XbaI T`CTAG,A 2801
MscI TGG|CCA 4156 XhoI C`TCGA,G 2795
NarI GG`CG,CC 4074 XmaI C`CCGG,G 3885
NheI G`CTAG,C 895      

pcDNA3.1-ACE2(1-615)質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下:

pcDNA3.1 primer (829-848): 5'- CTAGAGAACCCACTGCTTAC -3'

BGH pA primer (2832-2849): 5'- TAGAAGGCACAGTCGAGG -3'

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His的全序列信息:D2951 pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His序列.txt。

pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后的表達(dá)效果請(qǐng)參考圖1:

圖1:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SARS-CoV-2 ACE2(1-615)基因在HEK293T細(xì)胞的表達(dá)。1.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒;2.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SARS-CoV-2-ACE2(1-615)-His質(zhì)粒。使用碧Lipo8000™轉(zhuǎn)染試劑(C0533)將2µg pcDNA3.1或pcDNA3.1-SARS-CoV-2-ACE2(1-615)-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染六孔板中密度為80%左右的HEK293T細(xì)胞,37℃恒溫培養(yǎng)48h后,棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液,PBS洗滌三遍后加入150µl Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)充分裂解,4℃離心,取上清用BCA法測(cè)蛋白濃度,然后經(jīng)濃度4-20%的預(yù)制膠(P0524)電泳,每孔蛋白總量20µg,轉(zhuǎn)膜、封閉后使用1:1000稀釋的His抗體(AH367)室溫孵育1h,洗滌后1:1000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)室溫孵育1h,最后經(jīng)BeyoECL Star(P0018AS)化學(xué)發(fā)光,并使用BeyoImager™ 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(EI600)拍照記錄。

包裝清單:

產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
D2951-1μg pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His 1μg
D2951-100μg pcDNA3.1-ACE2(1-615)-His 100μg
說(shuō)明書 1份

保存條件:

-20℃保存。

注意事項(xiàng):

本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途,也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明:
1. 首次使用1μg包裝的本產(chǎn)品時(shí),請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)?梢酝ㄟ^(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定,或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2. 100μg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl,共1ml?梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D(zhuǎn)染細(xì)胞。

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