5C (人原代肝細(xì)胞功能維持組合物)，即Combination Of Five Chemicals For Long-term Functional Maintenance Of Primary Human Hepatocytes In Vitro，是用于體外人原代肝細(xì)胞功能長(zhǎng)期維持的5個(gè)化合物FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189的組合。
肝臟是人體內(nèi)重要的器官，負(fù)責(zé)代謝、解毒、造血凝血、免疫等功能。肝細(xì)胞是占肝臟80-90%的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是肝臟功能的主要承擔(dān)者。原代肝細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)為模擬肝臟疾病和分子機(jī)制研究提供了重要方法和材料。但是新鮮分離得到的原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)只能維持10-14天，在這過(guò)程中肝細(xì)胞功能會(huì)快速喪失，隨后變成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞，最后發(fā)生細(xì)胞凋亡。這對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞并模擬體內(nèi)疾病及研究分子機(jī)制帶來(lái)困難。因此，如何保持肝細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中性狀穩(wěn)定并與體內(nèi)功能一致，是肝臟研究領(lǐng)域長(zhǎng)期未解決的問(wèn)題和難題。
5C是根據(jù)2019年4月北京大學(xué)鄧宏魁教授研究組等在Science期刊發(fā)表的“Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro”(Xiang C, et al. Science. 2019 Apr 26;364(6438):399-402.)研發(fā)而成，該論文找到了五種關(guān)鍵的小分子抑制劑：FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189，并被科研人員稱作5C。該研究首先從比較新鮮分離的人原代肝細(xì)胞與培養(yǎng)24小時(shí)后的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜入手，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)24小時(shí)后肝細(xì)胞基因表達(dá)即發(fā)生變化，有15個(gè)主要的肝功能相關(guān)基因被下調(diào)達(dá)10倍。同時(shí)TGF信號(hào)通路被上調(diào)，提示原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時(shí)即觸發(fā)啟動(dòng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序，推動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)改變，正常肝細(xì)胞功能走向喪失。隨后通過(guò)加入TGF小分子抑制劑SB431542可以保持一定的上皮細(xì)胞性狀但是仍不能阻止肝功能相關(guān)基因表達(dá)被下調(diào)，提示仍存在其他負(fù)向調(diào)控肝細(xì)胞穩(wěn)定的信號(hào)。研究組繼續(xù)通過(guò)小分子藥物篩選，最終發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)液中加入5種化合物組合：FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189，可以很好地延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至四周，并在此期間有效保持肝細(xì)胞極性性狀和肝功能相關(guān)基因的穩(wěn)定表達(dá)。這5種化合物分別為cAMP激動(dòng)劑、TGF-抑制劑、Notch抑制劑、Wnt抑制劑和BMP抑制劑，這些信號(hào)通路主要涉及到肝細(xì)胞分化、增殖等過(guò)程，而抑制劑的加入可能模擬了體內(nèi)微環(huán)境中所釋放信號(hào)的綜合效應(yīng)，從而達(dá)到維持肝細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。
5C處理使得人原代肝細(xì)胞在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)條件下保持了原有的正常形態(tài)和生物學(xué)功能，并且通過(guò)檢測(cè)mRNA水平，發(fā)現(xiàn)5C處理后保持了肝細(xì)胞原有的基因表達(dá)模式。因?yàn)楦闻K是重要的解毒以及代謝器官，研究者們還檢測(cè)了用5C處理的肝原代細(xì)胞中CYP (Cytochrome P450)基因的表達(dá)及其酶活性，發(fā)現(xiàn)相較于新鮮分離培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞均沒(méi)有明顯差別。而且，在長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月以上的培養(yǎng)過(guò)程中，5C組合抑制了肝細(xì)胞的去分化，細(xì)胞整體基因表達(dá)譜與體內(nèi)的肝細(xì)胞高度相似，并長(zhǎng)期維持了白蛋白分泌、尿素合成、藥物代謝等肝細(xì)胞的功能�；�5C培養(yǎng)條件，科研人員成功建立了乙型肝炎病毒感染模型：持續(xù)高水平表達(dá)乙肝表面抗原、e抗原、合成乙肝病毒DNA等感染指標(biāo)，尤其是能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定產(chǎn)生乙肝病毒復(fù)制必需的cccDNA。
這種僅用5種小分子化合物組合應(yīng)用可以有效延長(zhǎng)原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間并保持其生物學(xué)功能穩(wěn)定，在時(shí)間上和功能上均保證了其作為體外模擬病毒感染模型的可行性。這對(duì)于探索病毒感染機(jī)制具有重要意義，也將為大規(guī)模抗病毒藥物篩選提供新方法。未來(lái)體外延長(zhǎng)培養(yǎng)的肝細(xì)胞是否可應(yīng)用于其他肝臟疾病體外模擬、干預(yù)和基因操作等研究值得一步探索。
表1. 5C中5個(gè)化合物的主要信息。
| 產(chǎn)品編號(hào) | 化合物名稱 | CAS號(hào) | 分子量 | 靶點(diǎn) | 包裝濃度 | 使用濃度 |
| S3200-1 | Forskolin (FSK) | 66575-29-9 | 410.50 | adenylate cyclase activator | 20mM (1000×) | 20μM |
| S3200-2 | SB431542 (SB43) | 301836-41-9 | 384.39 | TGF-β inhibitor | 10mM (1000×) | 10μM |
| S3200-3 | DAPT | 208255-80-5 | 432.46 | Notch inhibitor | 10mM (10,000×) | 1μM |
| S3200-4 | IWP-2 | 686770-61-6 | 466.60 | Wnt inhibitor | 5mM (10,000×) | 0.5μM |
| S3200-5 | LDN193189 (LDN) | 1062368-24-4 | 406.48 | BMP inhibitor | 1mM (10,000×) | 0.1μM |
按照Science 2019 Apr 26;364(6438):399-402該論文中的使用濃度，本產(chǎn)品可配制1L培養(yǎng)液。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| S3200S-1 | Forskolin (腺苷酸環(huán)化酶激活劑) | 20mM×1ml |
| S3200S-2 | SB431542 (TGF-β/Smad抑制劑) | 10mM×1ml |
| S3200S-3 | DAPT (Notch抑制劑) | 10mM×0.1ml |
| S3200S-4 | IWP-2 (Wnt抑制劑) | 5mM×0.1ml |
| S3200S-5 | LDN193189 (BMP抑制劑) | 1mM×0.1ml |
| — | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
本產(chǎn)品所有化合物的溶劑均為高純度DMSO。
本產(chǎn)品可能對(duì)人體有一定的毒害作用，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)，以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1.收到產(chǎn)品后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)推薦的條件保存。使用前可以在2,000-10,000g離心數(shù)秒，以使液體充分沉降至管底后再開(kāi)蓋使用。
2.具體的最佳工作濃度請(qǐng)參考本說(shuō)明書(shū)或其它相關(guān)文獻(xiàn)，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模约八囵B(yǎng)的特定原代細(xì)胞，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索和優(yōu)化。
