植物原生質體分離試劑盒(Plant Protoplasts Isolation Kit)，是一種能夠簡單、快捷地通過酶學方法消化植物尤其是擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞壁中的纖維素并釋放出大量且具有生物活性的原生質體的試劑盒。使用本試劑盒分離出的原生質體可用于質粒DNA轉染以及原生質體融合等實驗研究。

植物原生質體是指去除掉細胞壁后由細胞膜包被的具有生命活力的植物細胞體。植物細胞壁的主要成分為纖維素(cellulose)，半纖維素(hemicellulose)和果膠(pectin)等。植物細胞壁組分被適當?shù)拿赶�化降解后，就能釋放出無細胞壁包被的植物原生質體。原生質體是開展一系列植物細胞研究的重要材料，可以用于短時間基因表達(transient gene expression)、病毒感染(viral transfection)、體細胞雜交(somatic hybridization)、電生理研究(electrophysiological study)和形態(tài)學研究(morphological study)等，從而在植物亞細胞定位(subcellular localization)、蛋白活性分析以及蛋白與蛋白相互作用(protein-protein interaction)等研究方面發(fā)揮重要作用。

使用本試劑盒處理擬南芥葉片所獲得的原生質體效果圖(圖1)：

圖1. 植物原生質體分離試劑盒(Plant Protoplasts Isolation Kit)分離制備的擬南芥原生質體效果圖。酶解體系配制(5ml)：稱取0.095g Enzyme Mix，加入2.5ml 2X Digest Buffer，55℃水浴10min使酶充分溶解，冷卻至室溫后，分別加入100μl Digest Solution I，10μl Digest Solution II和50μl Digest Solution III，加無菌水定容至5ml，輕輕混勻并溶解后，用0.45μm針頭濾器(FF365)過濾。生長狀態(tài)良好的擬南芥葉片20片，去除葉片的尖端與基部，用刀片(FS205)切成0.5-1mm小條，浸入細胞壁消化液中，真空干燥器抽真空30min，避光條件下消化3h后，輕輕搖動并吸取少量消化液在光學顯微鏡下觀察游離的原生質體(圖A)。消化比較充分后，將所得原生質體溶液用1X Dilution Buffer進行等體積稀釋，再用70μm孔徑的細胞過濾器(FSTR070)過濾所獲得的原生質體溶液，以去除未消化完全的葉片，室溫下100g離心1min，去除上清，將其重懸于500μl Resuspension Buffer中，吸取100μl重懸的原生質體，光學顯微鏡下觀察原生質體的數(shù)量與形態(tài)(圖B)。實際的檢測效果會因檢測條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。

按照每次使用5ml細胞壁酶消化體系計算，本試劑盒可用于20次細胞壁酶消化反應。本試劑盒每個5ml反應體系可處理0.1g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5ml體系可獲得約50-70萬個原生質體(不同植物不同操作會有一定的差異)，可滿足約25-100個樣品的原生質體質粒轉染操作(按照每樣1-2萬個細胞計算)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少一年有效。C0362S-2 Enzyme Mix可長期4℃保存，其余組分4℃存放數(shù)天不會影響使用效果。數(shù)天內連續(xù)使用的情況，可以全部保存在4℃。

注意事項：

細胞壁消化液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存用于后續(xù)用途。

請按照試劑盒要求的保存條件存放相關試劑，使用時請將各溶液充分融解并混勻，盡量避免過多的反復凍融。

2X Digest Buffer (C0362S-1)以及Resuspension Buffer (C0362S-7)容易被微生物污染，使用時須嚴格按照無菌操作規(guī)范進行或者適當分裝后使用。

所制備的原生質體如果后續(xù)需要用于轉染、培養(yǎng)等相對較長時間的用途，所有操作都必須按照無菌操作規(guī)范進行。

需使用者自備的實驗儀器與耗材：水浴鍋(E0530)，0.45μm針頭濾器(FF365)，手術刀片(FS205)，平頭鑷子(FS035)，70μm細胞過濾器(FSTR070)以及離心管等其它耗材。

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.取如下條件生長的擬南芥葉片，或其它適當?shù)闹参锶~片等組織。
將擬南芥種植于溫室營養(yǎng)土中，短日照(10-13h light at 23℃/11-14h dark at 20℃)，弱光(50-75μEm-2s-1)條件下培養(yǎng)，保持相對濕度為40-65%，大約3-4周后可進行原生質體制備。
2.原生質體分離：
a.冰上解凍并混勻所需的各個組分，參考如下體系配制細胞壁消化液，并使用0.45μm針頭濾器(FF365)過濾除去不溶雜質，溶解好的細胞壁消化液應為澄清棕黃色溶液。55℃孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進酶溶解。

b.選取長勢較好的3-4周齡的擬南芥幼苗，取0.1g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，用刀片去除葉片的尖端與基部，或選擇適當?shù)钠渌�植物葉片等組織(宜盡量選擇柔嫩部位)，并將其切成0.5-1mm左右的小條，用平頭鑷子將切好的小條放入準備好的細胞壁消化液中并使其完全浸入。
c.使用玻璃真空干燥器室溫避光條件下抽真空30min，以使細胞壁消化液更好地進入細胞間隙。在室溫條件下，無需振搖，酶消化3h。細胞壁消化液在緩慢旋轉后變成綠色，表示已有原生質體釋放。注意：酶消化的時間不同植物不同部位會有較大的差別，3h為對于擬南芥葉片的推薦時間，實際操作時可以根據(jù)原生質體的釋放情況，酌情調整消化時間。真空泵使用實驗室內常用的用于吸除液體的真空泵即可，例如E0110、E0111、E0112、E0113、E0114或E0115真空泵。
d.顯微鏡下觀察和檢查原生質體的釋放情況，擬南芥原生質體大小約為30-50μm。無須等原生質體完全釋放出來后再進行后續(xù)操作的。如果消化時間過長，也會對原生質體產生一定的負面影響。
e.取適量5X Dilution Buffer，用水稀釋至1X，用等體積的1X Dilution Buffer稀釋原生質體，70μm細胞過濾器(FSTR070)或者75μm孔徑的尼龍篩網(wǎng)(約200目)過濾去除未消化的葉片組織。
f.收集濾液于50ml離心管，室溫100g離心1-2min，盡量去除上清，用5ml 1X Dilution Buffer重新懸浮原生質體，室溫靜置30min。
g.原生質體在重力作用下會在離心管底部沉降，盡量吸除上清，收集原生質體(如果發(fā)現(xiàn)原生質體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮室溫100g離心1-2min)，加入約1.5-2.5ml或更小體積的Resuspension Buffer，將原生質體以2×105/ml的密度或更高密度懸浮于重懸液中，即為原生質體懸液。制備好的原生質體可以在4℃或冰浴保存至少24h。
常見問題：
1.原生質體產量低及形態(tài)異常。
a.擬南芥的生長狀態(tài)對原生質體的分離效率有非常大的影響。擬南芥種子的生長及保存條件、土壤養(yǎng)分、溫度、濕度、光照周期、光照強度等諸多因素均可能會影響植物的生長狀態(tài)，且不同的擬南芥株系生長條件略有差異，故盡量保證合適的擬南芥生長條件并選用形態(tài)及生長良好的葉片進行原生質體分離。
b.檢查細胞壁消化液的配制是否正確。
c.確保加入Enzyme Mix后在55℃孵育了10min。
d.根據(jù)不同植物以及突變體株系適當調整酶消化的時間。
e.離心沉淀原生質體時離心力過高或時間過長。
f.葉片的碎條需要和細胞壁酶消化液充分接觸。如果葉片的碎條沒有及時放入到細胞壁酶消化液中而出現(xiàn)了干燥的情況，后續(xù)就較難被細胞壁酶消化液充分浸潤，從而會嚴重影響原生質體的得率。此外，抽真空，去除葉片碎條表面的微小氣泡，也是細胞壁酶消化液充分對細胞壁進行消化的必要條件。​​