總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(Total Glutathione Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的試劑盒。
谷胱甘肽(glutathione)是一種由3個(gè)氨基酸殘基組成的小肽，全稱為谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸，英文名稱為glutamyl-cysteinyl-glycine，簡(jiǎn)稱為glutathione。由于半胱氨酸上的巰基(SH)為谷胱甘肽的活性基團(tuán)，所以常簡(jiǎn)寫為G-SH或GSH。谷胱甘肽包括還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, 常稱為GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide)兩種形式。由于氧化型谷胱甘肽是由兩個(gè)GSH通過(guò)巰基脫氫而成，所以常簡(jiǎn)寫為G-S-S-G或GSSG。還原型谷胱甘肽是絕大多數(shù)活細(xì)胞中巰基的主要來(lái)源，對(duì)于維持蛋白質(zhì)中巰基適當(dāng)?shù)难趸�原狀態(tài)有重要作用，并且是動(dòng)物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑。總谷胱甘肽中通常90-95%為還原型谷胱甘肽。
通過(guò)谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG。適當(dāng)配制反應(yīng)體系，前后兩個(gè)反應(yīng)合并起來(lái)后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)顏色產(chǎn)生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通過(guò)測(cè)定A412就可以計(jì)算出總谷胱甘肽的量。
本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：
兩個(gè)反應(yīng)相合并：
本試劑盒可以檢測(cè)動(dòng)物組織、血漿、紅細(xì)胞、和培養(yǎng)細(xì)胞或其它適當(dāng)樣品中總谷胱甘肽的含量。
本試劑盒提供了蛋白去除試劑S，可以更加準(zhǔn)確地測(cè)定出含有蛋白的樣品中的總谷胱甘肽的量。
本試劑盒的檢測(cè)下限為1μM。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| S0052-1 | 總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 | 60ml |
| S0052-2 | 谷胱甘肽還原酶 | 150μl |
| S0052-3 | 還原型谷胱甘肽(GSH) | 4.5mg |
| S0052-4 | DTNB | 4.5mg |
| S0052-5 | 蛋白去除試劑S | 0.4g |
| S0052-6 | NADPH | 4mg |
| S0052-7 | DMSO | 1.5ml |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。還原型谷胱甘肽配制成溶液后，需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。DTNB溶解在DMSO中后，需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。蛋白去除試劑S配制成溶液后可以4℃保存。NADPH溶解后，適當(dāng)分裝，-70℃保存。
注意事項(xiàng)：
本試劑盒檢測(cè)時(shí)牽涉到氧化還原反應(yīng)，所有氧化劑或還原劑都會(huì)干擾本試劑盒的測(cè)定。特別是DTT、巰基乙醇等含有巰基的試劑會(huì)嚴(yán)重干擾本試劑盒的測(cè)定，請(qǐng)盡量避免。
一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)的溫度和反應(yīng)時(shí)間，否則需每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
NADPH等試劑不太穩(wěn)定，要嚴(yán)格按照后續(xù)說(shuō)明操作，謹(jǐn)防失活。
DMSO在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a.GSH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4.5mgGSH中加入1.5毫升Milli-Q級(jí)純水，溶解并混勻，即為GSH儲(chǔ)備液，濃度為10mM。除立即待用部分外，其余GSH儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
b.DTNB儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)備液。除立即待用部分外，其余DTNB儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.蛋白去除試劑S溶液的配制：在本試劑盒提供的0.4克蛋白去除試劑S中加入8毫升Milli-Q級(jí)純水，配制成8毫升5%的水溶液。4℃保存。
d.NADPH儲(chǔ)備液(40mg/ml)的配制：在本試劑盒提供的4mg NADPH中加入100微升Milli-Q級(jí)純水，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)備液。除立即待用部分外，其余NADPH儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-70℃保存。
e.5倍稀釋谷胱甘肽還原酶的配制：取50微升谷胱甘肽還原酶，加入200微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻，即成5倍稀釋的谷胱甘肽還原酶。
f.總谷胱甘肽檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待檢測(cè)的樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，表中三種試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測(cè)工作液。
| 1個(gè)樣品 | 10個(gè)樣品 | 20個(gè)樣品 | |
| 5倍稀釋谷胱甘肽還原酶 | 6.6 μl | 66 μl | 132 μl |
| DTNB儲(chǔ)備液 | 6.6 μl | 66 μl | 132 μl |
| 總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 | 150 μl | 1.5 ml | 3 ml |
g.0.5mg/ml NADPH的配制：取10微升NADPH儲(chǔ)備液，加入790微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻即為0.5mg/ml NADPH。每檢測(cè)一個(gè)樣品需50微升0.5mg/ml NADPH。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：
把10mM GSH儲(chǔ)備液用蛋白去除試劑S溶液稀釋成50μM GSH溶液。然后依次稀釋成25、15、10、5、2μM GSH溶液。取50、25、15、10、5、2μM GSH溶液六個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSH在蛋白去除試劑S溶液中不太穩(wěn)定，用蛋白去除試劑S溶液配制的GSH溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。
3. 樣品的準(zhǔn)備：
a.組織樣品的準(zhǔn)備。取組織用液氮速凍，然后研成粉末。每10毫克研碎的組織粉末，加入30微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。再加入70微升蛋白去除試劑S溶液，用玻璃勻漿器充分勻漿(對(duì)于比較容易勻漿的組織可以不用液氮速凍等處理，而直接加入適量蛋白去除試劑S溶液進(jìn)行勻漿)。4℃放置10分鐘后，10,000g 4℃離心10分鐘，取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的組織樣品通常需用蛋白去除試劑S溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)通常為5-20倍。
b.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液，即如果細(xì)胞沉淀為10微升，則加入30微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。(細(xì)胞沉淀的體積可以根據(jù)細(xì)胞沉淀的重量進(jìn)行估算。收集細(xì)胞前后分別對(duì)離心管進(jìn)行稱重，從而就可以計(jì)算出細(xì)胞沉淀的重量。10毫克細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10微升。) 然后利用液氮和37℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速的凍融。4℃或冰浴放置5分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的細(xì)胞樣品通常需用蛋白去除試劑S溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)可以高達(dá)20倍。
c.紅細(xì)胞或血漿樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測(cè)定。600g離心10分鐘，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。對(duì)于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。取約50微升紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入50微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。4℃或冰浴放置10分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的紅細(xì)胞樣品最后需用蛋白去除試劑S溶液稀釋10倍后再進(jìn)行后續(xù)的測(cè)定，而對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取10微升進(jìn)行測(cè)定。
d.對(duì)于一些谷胱甘肽含量特別低的樣品，可以通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行濃縮后再進(jìn)行測(cè)定。
4.樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定：
a.參考下表，使用96孔板，依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。加入150微升總谷胱甘肽檢測(cè)工作液后，混勻，25℃或室溫孵育5分鐘。
| 空白對(duì)照 (blank) | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 (standard) | 樣品(sample) | |
| 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 | 0 μl | 10 μl | x μl |
| 蛋白去除試劑S溶液 | 10 μl | 0 μl | 10-x μl |
| 總谷胱甘肽檢測(cè)工作液 | 150 μl | 150 μl | 150 μl |
| 25℃或室溫孵育 | 5 min | 5 min | 5 min |
| 0.5mg/ml NADPH | 50 μl | 50 μl | 50 μl |
b.加入50微升0.5mg/ml NADPH溶液，混勻。
c.立即用酶標(biāo)儀測(cè)定A412，每5分鐘測(cè)定一次或?qū)崟r(shí)測(cè)定，共測(cè)定25分鐘，測(cè)得5個(gè)數(shù)據(jù)。(說(shuō)明：為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，可以在加入NADPH溶液混勻后25分鐘，僅測(cè)定一次A412)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則就在室溫狀況下測(cè)定。如果酶標(biāo)儀不能測(cè)定A412，可以測(cè)定405-414nm附近范圍的吸光度。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣品的吸光度比較低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30-60分鐘，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度在一定范圍內(nèi)會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)接近于線性增加的。
d.標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)效果參考圖1。
圖1. GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)測(cè)效果圖。圖中數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)際的檢測(cè)效果可能會(huì)因具體反應(yīng)條件的不同而有所不同。5.樣品中總谷胱甘肽含量的計(jì)算：
a.單點(diǎn)測(cè)定法：即反應(yīng)25分鐘(或30-60分鐘)后僅測(cè)定一次吸光度。根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的不同吸光度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出總谷胱甘肽的含量。實(shí)際計(jì)算出來(lái)的總谷胱甘肽的含量相當(dāng)于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上還原型谷胱甘肽的含量。單點(diǎn)法測(cè)定相對(duì)比較便捷，而動(dòng)力學(xué)法測(cè)定則相對(duì)比較精確。
b.動(dòng)力學(xué)測(cè)定法：先根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定得到的吸光度值計(jì)算出ΔA412/min。然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以ΔA412/min為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的ΔA412/min，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算出測(cè)定時(shí)樣品中總谷胱甘肽的含量。
c.同時(shí)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計(jì)算出每毫克組織或細(xì)胞中的總谷胱甘肽的含量。對(duì)于細(xì)胞樣品，也可以根據(jù)最初細(xì)胞的使用數(shù)量，然后另外取一定數(shù)量的細(xì)胞裂解后測(cè)定蛋白濃度，從而計(jì)算出細(xì)胞樣品的蛋白量，最后計(jì)算出每毫克蛋白中總谷胱甘肽的含量。
