GSH和GSSG檢測試劑盒(GSH and GSSG Assay Kit)是一種簡單易行的可以分別檢測出GSH(還原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽，oxidized glutathione disulfide)含量的檢測試劑盒。

谷胱甘肽(glutathione)是一種由3個氨基酸殘基組成的小肽，全稱為谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸，英文名稱為glutamyl-cysteinyl-glycine，簡稱為glutathione。由于半胱氨酸上的巰基(SH)為谷胱甘肽的活性基團，所以常簡寫為G-SH或GSH。谷胱甘肽包括還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, 常稱為GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide)兩種形式。由于氧化型谷胱甘肽是由兩個GSH通過巰基脫氫而成，所以常簡寫為G-S-S-G或GSSG。還原型谷胱甘肽是絕大多數(shù)活細胞中巰基的主要來源，對于維持蛋白質(zhì)中巰基適當?shù)难趸�還原狀態(tài)有重要作用，并且是動物細胞中關(guān)鍵的抗氧化劑�？偣入赘孰闹型ǔ�90-95%為還原型谷胱甘肽。
通過谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG。適當配制反應(yīng)體系，前后兩個反應(yīng)合并起來后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當于一個顏色產(chǎn)生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通過測定A412就可以計算出總谷胱甘肽的量。用適當試劑先清除樣品中的GSH，然后利用上述反應(yīng)原理就可以測定出GSSG的含量。用總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除GSSG的含量，就可以計算出GSH的含量。
本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：

兩個反應(yīng)相合并：

本試劑盒可以檢測動物組織、血漿、紅細胞、和培養(yǎng)細胞或其它適當樣品中GSH和GSSG的含量。
本試劑盒提供了蛋白去除試劑M，可以更加準確地測定出含有蛋白的樣品中的GSH和GSSG的量。
本試劑盒的檢測下限為0.5μM。一個試劑盒共可以進行100次檢測，可以測定100個樣品的總谷胱甘肽或GSSG的含量，或可以測定出50個樣品中GSH和GSSG的各自含量。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。GSSG配制成溶液后，需適當分裝，-20℃保存至少3個月有效。DTNB溶解于DMSO后，需適當分裝，-20℃保存至少3個月有效。蛋白去除試劑M配制成溶液后僅限當天使用。NADPH溶解后，適當分裝，-70℃保存。稀釋的GSH清除輔助液和GSH清除試劑溶液均須新鮮配制使用。
注意事項：
本試劑盒檢測時牽涉到氧化還原反應(yīng)，所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定。特別是DTT、巰基乙醇等含有巰基的試劑會嚴重干擾本試劑盒的測定，請盡量避免。
一定要嚴格控制反應(yīng)時的溫度和反應(yīng)時間，否則每次都需做標準曲線。
NADPH等試劑不太穩(wěn)定，要嚴格按照后續(xù)說明操作，謹防失活。
蛋白去除試劑M溶液必須新鮮配制并限當日使用。GSH清除試劑也須新鮮稀釋后使用。
蛋白去除試劑M較難溶解，可以通過劇烈vortex并適當加熱(不超過37℃)以促進溶解。
DMSO在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.試劑盒的準備工作：
a.GSSG儲備液的配制：在本試劑盒提供的5mg GSSG中加入816微升Milli-Q級純水，溶解并混勻，即為GSSG儲備液，濃度為10mM。除立即待用部分外，其余GSSG儲備液適當分裝后-20℃保存。
b.DTNB儲備液的配制：在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲備液。除立即待用部分外，其余DTNB儲備液適當分裝后-20℃保存。
c.蛋白去除試劑M溶液的配制：稱取0.2克蛋白去除試劑M，加入4毫升總谷胱甘肽檢測緩沖液，配制成4毫升5%的水溶液。蛋白去除試劑M溶液必須新鮮配制并限當天使用。
d.NADPH儲備液(40mg/ml)的配制：在本試劑盒提供的4mg NADPH中加入100微升Milli-Q級純水，溶解并混勻，即為NADPH儲備液。除立即待用部分外，其余NADPH儲備液適當分裝后-70℃保存。
e.5倍稀釋谷胱甘肽還原酶的配制：取50微升谷胱甘肽還原酶，加入200微升總谷胱甘肽檢測緩沖液，混勻，即成5倍稀釋的谷胱甘肽還原酶。
f.總谷胱甘肽檢測工作液的配制：根據(jù)待檢測的樣品數(shù)參考下表配制適當量的總谷胱甘肽檢測工作液，表中三種試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測工作液。

g.  0.5mg/ml NADPH的配制：取10微升NADPH儲備液，加入790微升總谷胱甘肽檢測緩沖液，混勻即為0.5mg/ml NADPH。每檢測一個樣品需50微升0.5mg/ml NADPH。
h.  稀釋的GSH清除輔助液的配制：在47微升Milli-Q級純水中加入53微升GSH清除輔助液，立即混勻。稀釋后的GSH清除輔助液不太穩(wěn)定，每次使用時均須新鮮配制，并僅限當日使用。
i.  GSH清除試劑工作液的配制：10.8微升GSH清除試劑中加入89.2微升無水乙醇，立即混勻。GSH清除劑工作液每次也須新鮮配制。
2.標準品的準備：
a.  把10mM GSSG儲備液用蛋白去除試劑M溶液稀釋成15μM GSSG溶液。然后依次稀釋成10、5、2、1、0.5μM GSSG溶液。取15、10、5、2、1、0.5μM GSSG溶液六個點做標準曲線。注意：由于GSSG在蛋白去除試劑M溶液中不太穩(wěn)定，用蛋白去除試劑M溶液配制的GSSG溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。
b.  如果需要測定樣品中GSSG含量，按照每100微升標準品加入20微升稀釋的GSH清除輔助液的比例加入稀釋的GSH清除輔助液，立即vortex混勻。然后按照每100微升標準品加入4微升GSH清除試劑工作液的比例加入GSH清除試劑工作液，立即vortex混勻，25℃反應(yīng)60分鐘。即可用于后續(xù)的GSSG含量的檢測。
3.待測總谷胱甘肽含量樣品和標準品的準備：
a.組織樣品的準備。取組織用液氮速凍，然后研成粉末。每10毫克研碎的組織粉末，加入30微升蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex。再加入70微升蛋白去除試劑M溶液，用玻璃勻漿器充分勻漿(對于比較容易勻漿的組織可以不用液氮速凍等處理，而直接加入適量蛋白去除試劑M溶液進行勻漿)。4℃放置10分鐘后，10,000g 4℃離心10分鐘，取上清用于總谷胱甘肽的測定。樣品需暫時4℃保存，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對于處理好的組織樣品通常需用蛋白去除試劑M溶液進行適當稀釋后再進行測定，稀釋倍數(shù)通常為5-20倍。
b.細胞樣品的準備。請盡量使用新鮮的細胞進行測定，而不要使用凍存的細胞進行測定。PBS洗滌細胞一次，離心收集細胞，吸盡上清。加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑M溶液，即如果細胞沉淀為10微升，則加入30微升蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex。(細胞沉淀的體積可以根據(jù)細胞沉淀的重量進行估算。收集細胞前后分別對離心管進行稱重，從而就可以計算出細胞沉淀的重量。10毫克細胞沉淀的體積可以粗略地看做10微升。) 然后利用液氮和37℃水浴對樣品進行兩次快速的凍融。4℃或冰浴放置5分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測定。樣品需暫時4℃保存，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對于處理好的細胞樣品通常需用蛋白去除試劑M溶液進行適當稀釋后再進行測定，稀釋倍數(shù)可以高達20倍。
c.紅細胞或血漿樣品的準備。請盡量使用新鮮的血液進行測定。600g離心10分鐘，沉淀為紅細胞，上清為血漿。對于紅細胞，用PBS洗滌兩次。取約50微升紅細胞沉淀或血漿，加入50微升蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex。4℃或冰浴放置10分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測定。樣品需暫時4℃保存，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對于處理好的紅細胞樣品最后需用蛋白去除試劑M溶液稀釋10倍后再進行后續(xù)的測定，而對于血漿樣品，應(yīng)直接取10微升進行測定。
d.說明：對于一些谷胱甘肽含量特別低的樣品，可以通過冷凍干燥進行濃縮后再進行測定。
4. 待測GSSG含量樣品的準備：
取部分上述準備好的待測總谷胱甘肽含量的樣品，按照每100微升樣品加入20微升稀釋的GSH清除輔助液的比例加入稀釋的GSH清除輔助液，立即vortex混勻。再按照每100微升樣品加入4微升GSH清除試劑工作液的比例加入GSH清除工作液，立即vortex混勻，25℃反應(yīng)60分鐘。通過上述反應(yīng)可以清除高達50μM的GSH，如果樣品中GSH含量過高需進行適當稀釋后再進行去除GSH的操作。通過上述處理就可以用于后續(xù)的測定。
5. 樣品和標準品的測定：
a.  參考下表，使用96孔板，依次加入樣品或標準品，混勻。加入150微升總谷胱甘肽檢測工作液后，混勻，25℃或室溫孵育5分鐘。

b.加入50微升0.5mg/ml NADPH溶液，混勻。
c.立即用酶標儀測定A412，每5分鐘測定一次或?qū)崟r測定，共測定25分鐘，測得5個數(shù)據(jù)。(說明：為了簡化實驗步驟，可以在加入NADPH溶液混勻后25分鐘，僅測定一次A412)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則就在室溫狀況下測定。如果酶標儀不能測定A412，可以測定405-414nm附近范圍的吸光度。如果標準曲線良好，但樣品的吸光度比較低，可以延長孵育時間至30-60分鐘，標準品和樣品的吸光度在一定范圍內(nèi)會隨時間的延長接近于線性增加的。
注意：如果進行GSSG含量測定，標準品也須平行地進行去除GSH的相關(guān)操作，以減小誤差。如果樣品需同時測定總谷胱甘肽含量和GSSG含量，由于兩者的檢測體系不同，須分別單獨做標準曲線。
d.標準品的實測效果參考圖1。
圖1. GSSG標準曲線實測效果圖。圖中數(shù)據(jù)僅供參考，實際的檢測效果可能會因具體反應(yīng)條件的不同而有所不同。6.樣品中總谷胱甘肽含量的計算：
a.單點測定法：即反應(yīng)25分鐘(或30-60分鐘)后僅測定一次吸光度。根據(jù)不同濃度標準品測得的不同吸光度作出標準曲線。樣品對照標準曲線即可計算出總谷胱甘肽(標準曲線計算得到的GSSG濃度乘以2)或GSSG的含量。實際計算出來的總谷胱甘肽的含量相當于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上還原型谷胱甘肽的含量。單點法測定相對比較便捷，而動力學(xué)法測定則相對比較精確。注意：由于1個GSSG分子反應(yīng)后可以還原成2個GSH分子，所以GSSG的濃度如果換算成GSH的濃度時需乘以2，例如完全清除樣品中內(nèi)源GSH的情況下，GSSG的濃度為5μM，則相當于GSH的濃度為10μM。
b.動力學(xué)測定法：先根據(jù)不同時間點測定得到的吸光度值計算出ΔA412/min。然后以標準品的濃度為橫坐標，以ΔA412/min為縱坐標，做出標準曲線。根據(jù)樣品的ΔA412/min，對照標準曲線就可以計算出測定時樣品中總谷胱甘肽或GSSG的含量。
c.同時根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)以及最初樣品的使用量，可以計算出每毫克組織或細胞中的總谷胱甘肽或GSSG的含量。對于細胞樣品，也可以根據(jù)最初細胞的使用數(shù)量，然后另外取一定數(shù)量的細胞裂解后測定蛋白濃度，從而計算出細胞樣品的蛋白量，最后計算出每毫克蛋白中總谷胱甘肽或GSSG的含量。
d.根據(jù)測定得到的總谷胱甘肽的含量和GSSG的含量就可以計算出GSH的含量。
計算公式為：GSH=Total Glutathione-GSSG×2 (注意：Total Glutathione為通過標準曲線計算得到的GSSG濃度乘以2，同時清除GSH后得到的GSSG也要乘以2，因為1個GSSG分子在反應(yīng)后可以還原成2個GSH分子)。例如通過本試劑盒測定的總谷胱甘肽(Total Glutathione)的濃度是15μM (即在測定總谷胱甘肽時通過標準曲線計算得到的GSSG濃度為7.5μM，乘以2即為總谷胱甘肽濃度)，測定的GSSG的濃度是1.2μM (即在單獨測定GSSG含量時通過標準曲線計算得到的GSSG濃度為1.2μM)，那么樣品中GSH的濃度為15-1.2×2=12.6μM。

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