總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-8)是一種基于WST-8的顯色反應(yīng),通過比色來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用,生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2),是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。
目前有多種SOD活性測定法,其中NBT(氮藍(lán)四唑)法由于使用方便而被廣泛使用。但NBT法產(chǎn)生的甲臜染料水溶性差,易和被還原的黃嘌呤氧化酶相互作用,抑制百分率達(dá)不到100%等,從而使檢測的靈敏度和精確度受到影響;細(xì)胞色素C法也是一種常用來檢測SOD活性的方法,但細(xì)胞色素C其氧化活性高,易受樣品中的還原劑干擾,另外該方法需要連續(xù)測定吸光度值,對于SOD的檢測靈敏度比較低,并且不太適合大批量樣本的檢測。
目前測定SOD比較先進(jìn)的方法包括WST-1法和WST-8法,其中WST-8法比WST-1法更加穩(wěn)定、靈敏度更高。本試劑盒采用了目前測定SOD方法中穩(wěn)定性更好、靈敏度更高的WST-8法,可以檢測出低達(dá)0.5U/ml的超氧化物歧化酶。WST-8法的原理參考圖1,WST-8可以和黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化產(chǎn)生的超氧化物陰離子(O2.-)反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲臜染料(formazan dye),由于SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用,所以該反應(yīng)步驟可以被SOD所抑制,因此SOD的活性與甲臜染料的生成量成負(fù)相關(guān),從而通過對WST-8產(chǎn)物的比色分析即可計(jì)算SOD的酶活力。
圖1. 基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系和WST-8的SOD酶活力檢測原理圖。XO:xanthine oxidase。
WST-8的反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物,可以通過單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度檢測來測定SOD活力,適合高通量篩選研究。同時(shí)WST-8法測定SOD酶活力時(shí),最大抑制百分率可以接近100%,并且可以不受一些常見的干擾因素的干擾,使檢測效果比其它的一些常見方法顯著改善。
本試劑盒的性能優(yōu)于同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)。本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)相同,等量SOD導(dǎo)致的吸光度變化值顯著大于NBT法,線性范圍更寬。本試劑盒提供的SOD樣品制備液能直接裂解細(xì)胞,無需勻漿,操作更加便捷。
本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細(xì)胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫,會(huì)干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法,能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如,對于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測,標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達(dá)0.1mM的過氧化氫時(shí),對于檢測結(jié)果仍無顯著影響。
本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清等生物樣品中的SOD活性。本試劑盒S0101S包裝共可以進(jìn)行100次檢測,S0101M包裝共可以進(jìn)行250次檢測。
包裝清單:
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
S0101S-1 | SOD樣品制備液 | 50ml |
S0101S-2 | SOD檢測緩沖液 | 50ml |
S0101S-3 | WST-8 | 800μl |
S0101S-4 | 酶溶液 | 100μl |
S0101S-5 | 反應(yīng)啟動(dòng)液(40X) | 60μl |
— | 說明書 | 1份 |
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
S0101M-1 | SOD樣品制備液 | 125ml |
S0101M-2 | SOD檢測緩沖液 | 125ml |
S0101M-3 | WST-8 | 2ml |
S0101M-4 | 酶溶液 | 250μl |
S0101M-5 | 反應(yīng)啟動(dòng)液(40X) | 150μl |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
-20℃保存,半年有效。S0101-3 WST-8需避光保存。
注意事項(xiàng):
待測樣品-70℃可保存1個(gè)月。需注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致SOD部分失活。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)所用的稀釋液應(yīng)盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí),標(biāo)準(zhǔn)品也宜使用SOD樣品制備液進(jìn)行稀釋;當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時(shí),宜使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
抗氧化物會(huì)對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾,例如0.1mM ascorbic acid,5mM GSH都會(huì)使測定出來的吸光度顯著升高。此時(shí)盡管樣品沒有顏色,如果設(shè)置了使用說明中的空白對照3,就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1.樣品的準(zhǔn)備:
a.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:對于貼壁細(xì)胞,吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液,用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍,按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入本試劑盒提供的SOD樣品制備液,適當(dāng)吹打以充分裂解細(xì)胞;對于懸浮細(xì)胞,600g離心5分鐘收集細(xì)胞,用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍,按照每100萬細(xì)胞加入100-200微升的比例加入SOD樣品制備液,適當(dāng)吹打,以充分裂解細(xì)胞。4℃約12,000g離心3-5分鐘,取上清作為待測樣品。
b.組織樣品的準(zhǔn)備:動(dòng)物用生理鹽水(0.9% NaCl,含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品,按照每10mg組織加入100微升SOD樣品制備液的比例在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動(dòng)勻漿器)。4℃約12,000g離心3-5分鐘,取上清作為待測樣品。
c.血漿或紅細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:用抗凝管收集血液,顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘,移取上清至另一新的1ml離心管中,適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟1a 懸浮細(xì)胞樣品的制備方法,或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d.上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大,該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。
e.根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量,用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如,小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為1:10)上清,通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定,可以冰浴保存;如果當(dāng)天不能完成測定,可以-70℃凍存,但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作:
a.WST-8/酶工作液的配制:按照每個(gè)反應(yīng)160μl的體積配制適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151μl SOD檢測緩沖液、8μl WST-8和1μl酶溶液,即可配制成160μl WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量,配制適量的WST-8/酶工作液。具體配制方法可以參考下表。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存,可以在當(dāng)天使用,但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意:由于酶溶液的用量較少且易沉降,必須注意在使用前先輕輕離心一下,然后適當(dāng)混勻后再使用。
待測樣品數(shù)量 | 1 | 10 | 20 | 50 |
SOD檢測緩沖液(μl) | 151 | 1510 | 3020 | 7550 |
WST-8(μl) | 8 | 80 | 160 | 400 |
酶溶液(μl) | 1 | 10 | 20 | 50 |
WST-8/酶工作液(μl) | 160 | 1600 | 3200 | 8000 |
b.反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制:把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)融解后混勻,按照每1μl反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)加入39μl SOD檢測緩沖液的比例進(jìn)行稀釋,混勻后即為反應(yīng)啟動(dòng)工作液。根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量,配制適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存,可以在當(dāng)天使用,但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
c.(可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備:需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品,用本試劑盒提供的SOD樣品制備液(當(dāng)樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時(shí))或SOD檢測緩沖液(當(dāng)樣品為血液等無需處理的樣品時(shí))將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度:100U/ml,50U/ml,20U/ml,10U/ml,5U/ml,2U/ml,1U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升,參考樣品進(jìn)行檢測。SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果參考圖2。說明:為避免稀釋后SOD酶活性的下降,SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用;本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品,但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
3.樣品測定:
a.參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意:加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開始,可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
樣品(Sample)/標(biāo)準(zhǔn)品 | 空白對照1(Blank1) | 空白對照2(Blank2) | 空白對照3 (Blank3)* | |
待測樣品 | 20μl | - | - | 20μl |
SOD檢測緩沖液 | - | 20μl | 40μl | 20μl |
WST-8/酶工作液 | 160μl | 160μl | 160μl | 160μl |
反應(yīng)啟動(dòng)工作液 | 20μl | 20μl | - | - |
*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì),則需設(shè)置空白對照3;如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對照3。
b.37℃孵育30分鐘。說明:孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異,但為保證檢測結(jié)果的一致性,推薦孵育30分鐘。
c.在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片,可以使用420-480nm的濾光片?梢赃x擇設(shè)定600nm (或600nm以上,如650nm)作為參比波長(也稱參考波長),450nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長的吸光度讀數(shù)即可作為實(shí)測讀數(shù)。
4.樣品中總SOD活力的計(jì)算:
a.抑制百分率的計(jì)算:
參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率:
抑制百分率=[(A空白對照1-A空白對照2)-(A樣品-A空白對照3)]/(A空白對照1-A空白對照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物,則A空白對照2 = A空白對照3,此時(shí)可以把計(jì)算公式簡化 為如下形式(簡化時(shí)可以不設(shè)置空白對照3):
抑制百分率 = (A空白對照1-A樣品) / (A空白對照1-A空白對照2) × 100%
如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需適當(dāng)稀釋樣品;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品。
b.SOD酶活力單位的定義:在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí),反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。注意:SOD的活力單位的定義方式有很多種,不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。
c.SOD酶活力的計(jì)算:
圖2. 本試劑盒對SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果。圖A縱坐標(biāo)ΔA450為孵育30分鐘后,空白對照1與SOD標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA450及抑制百分率(圖B)呈非線性關(guān)系,而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關(guān)系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考,實(shí)際測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能會(huì)因具體反應(yīng)條件的不同和上圖有較明顯的差別。
SOD酶活力的計(jì)算公式如下:
待測樣品中SOD酶活力單位=檢測體系中SOD酶活力單位=抑制百分率/(1-抑制百分率)units
例如,當(dāng)抑制百分率為50%時(shí),待測樣品中SOD酶活力單位=50% / (1-50%)units=1 unit;當(dāng)抑制百分率為60%時(shí),待測樣品中SOD酶活力單位=60% / (1-60%)units=1.5 units。
d.如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液,可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù),將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液,可以根據(jù)血紅蛋白含量,可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1:SOD酶活力計(jì)算的參考方案:可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線,然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考,使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測和計(jì)算。此外,本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠,不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。
附2:SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測:如果條件許可,使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時(shí)在450nm連續(xù)測定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率:
抑制百分率=[(斜率空白對照1-斜率空白對照2)-(斜率樣品-斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1-斜率空白對照2)×100%
其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測和計(jì)算更加精確一些,但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。