脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒(Lipid Peroxidation MDA Assay Kit)采用一種基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，隨后通過比色法用于對(duì)血漿、血清、尿液、動(dòng)植物組織或細(xì)胞裂解液中MDA進(jìn)行定量檢測(cè)，廣泛用于脂質(zhì)氧化(lipid peroxidation)水平檢測(cè)的試劑盒。
丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物。動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括MDA。此時(shí)通過檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平，因此MDA的測(cè)定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標(biāo)。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化產(chǎn)生，但只要在測(cè)定時(shí)設(shè)置適當(dāng)對(duì)照即可觀察到脂質(zhì)氧化水平的變化。
丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，相應(yīng)的反應(yīng)原理圖如下：
MDATBAMDA-TBA Adduct
MDA-TBA加合物在535nm處有最大吸收，據(jù)此可以通過比色法進(jìn)行檢測(cè)。另外，MDA-TBA加合物也可以在535nm被激發(fā)產(chǎn)生最大發(fā)射波長(zhǎng)553nm，據(jù)此也可以進(jìn)行熒光檢測(cè)。
特點(diǎn)：本試劑盒中采用了特殊的抗氧化劑，可以有效地抑制樣品在檢測(cè)過程中產(chǎn)生新的MDA，使檢測(cè)更加準(zhǔn)確。同時(shí)本檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)過程中可以把部分MDA天然形成的聚丙二醛分解成MDA，使對(duì)脂質(zhì)氧化的測(cè)定更加準(zhǔn)確。
本試劑盒可以檢測(cè)低達(dá)1μM的MDA，也可檢測(cè)高達(dá)200μM的MDA (參考圖1)。血漿、血清樣品中的MDA含量通常在約2-4μM，尿液中的MDA含量通常在約5-30μM，在本試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi)，可以直接用本試劑盒檢測(cè)血漿、血清、尿液樣品等。
圖1. 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品使用本試劑盒的檢測(cè)效果圖。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本試劑盒S0131S包裝共可進(jìn)行100次檢測(cè)，S0131M包裝共可進(jìn)行500次檢測(cè)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| S0131S-1 | TBA | 25mg |
| S0131S-2 | TBA配制液 | 6.76ml |
| S0131S-3 | TBA稀釋液 | 15ml |
| S0131S-4 | 抗氧化劑 | 300μl |
| S0131S-5 | 標(biāo)準(zhǔn)品(1mM) | 200μl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| S0131M-1 | TBA | 125mg |
| S0131M-2 | TBA配制液 | 35ml |
| S0131M-3 | TBA稀釋液 | 75ml |
| S0131M-4 | 抗氧化劑 | 1.5ml |
| S0131M-5 | 標(biāo)準(zhǔn)品(1mM) | 1ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。S0131-1 TBA和S0131-4抗氧化劑需避光保存。S0131-1 TBA、S0131-2 TBA配制液和S0131-3 TBA稀釋液可室溫或4℃存放三個(gè)月。
注意事項(xiàng)：
醛、較高濃度的可溶性糖(例如250mM蔗糖)對(duì)反應(yīng)有干擾，可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532nm也有吸收(最大吸收在450nm)。如果可溶性糖對(duì)測(cè)定有干擾，可以通過測(cè)定450nm作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，消除其干擾。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品的準(zhǔn)備：
a. 血漿、血清或尿液樣品制備后可以直接用于MDA測(cè)定。
b. 組織或細(xì)胞可以使用PBS或Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)等裂解液進(jìn)行勻漿或裂解。對(duì)于組織，組織重量占勻漿液或裂解液的比例為10%；對(duì)于細(xì)胞，每100萬細(xì)胞使用0.1ml裂解液或勻漿液。勻漿或裂解后，10,000g-12,000g離心10分鐘取上清用于后續(xù)測(cè)定。對(duì)于一些特殊樣品，離心不能獲得澄清的上清溶液的，可以使用0.2微米孔徑的過濾器過濾以獲得澄清的樣品溶液。勻漿或裂解等樣品制備步驟宜在冰浴或4℃進(jìn)行操作。
c. 對(duì)于組織或細(xì)胞樣品，樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測(cè)定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的MDA含量。
d. 本試劑盒對(duì)于樣品中的常見化學(xué)成分的兼容性參考下表：
| 試劑類別 | 化學(xué)成分 | 是否干擾 |
| 緩沖試劑 | Borate (50mM) | 否 |
| HEPES (100mM) | 否 | |
| Phosphate (100mM) | 否 | |
| Tris (25mM) | 否 | |
| 去垢劑 | CHAPS (≤1%) | 否 |
| Triton X-100 (≤1%) | 否 | |
| Tween 20 (≤1%) | 否 | |
| 抑制劑/螯合劑 | Antipain (≤100μg/ml) | 否 |
| Chymostatin (≤10μg/ml) | 否 | |
| Leupeptin (≤10μg/ml) | 否 | |
| PMSF (≤200μM) | 否 | |
| Trypsin (≤10μg/ml) | 否 | |
| EDTA(≤1mM) | 否 | |
| EGTA(≤1mM) | 否 | |
| 其它試劑 | Sucrose(250mM) | 是 |
| Glycerol(≤10%) | 否 |
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. TBA儲(chǔ)存液的配制：稱取適量TBA，用TBA配制液配制成濃度為0.37%的TBA儲(chǔ)存液。例如18.5mg TBA用5ml TBA配制液配制，或者25mg TBA用6.76ml TBA配制液配制，最終濃度即為0.37%。TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加熱到70℃以促進(jìn)溶解。TBA儲(chǔ)存液較難溶解，需加熱到70℃，并通過劇烈Vortex以促進(jìn)溶解。配制好的TBA儲(chǔ)存液室溫避光保存，至少3個(gè)月內(nèi)有效。
b. MDA檢測(cè)工作液的配制: 根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的MDA檢測(cè)工作液
| 檢測(cè)次數(shù) | 1次 | 10次 | 20次 | 50次 |
| TBA稀釋液 | 150μl | 1500μl | 3000μl | 7500μl |
| TBA儲(chǔ)存液 | 50μl | 500μl | 1000μl | 2500μl |
| 抗氧化劑 | 3μl | 30μl | 60μl | 150μl |
注意: MDA檢測(cè)工作液較難溶解，可以70℃加熱，并劇烈Vortex以促進(jìn)溶解。也可以通過超聲處理以促進(jìn)溶解。配制好的MDA檢測(cè)工作液必須當(dāng)天使用。
c. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：取適量標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50μM，用于后續(xù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果樣品中MDA的濃度很高，可以增加100、150和200μM的標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
3. 樣品測(cè)定:
a. 在離心管或其它適當(dāng)容器內(nèi)加入0.1ml勻漿液、裂解液或PBS等適當(dāng)溶液作為空白對(duì)照，加入0.1ml上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入0.1ml樣品用于測(cè)定；隨后加入0.2ml MDA檢測(cè)工作液�？蓞⒖枷卤碓O(shè)置檢測(cè)反應(yīng)體系：
| 空白對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)品 | 樣品 | |
| 勻漿液、裂解液或PBS | 0.1ml | － | － |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | － | 0.1ml | － |
| 待測(cè)樣品 | － | － | 0.1ml |
| MDA檢測(cè)工作液 | 0.2ml | 0.2ml | 0.2ml |
b. 混勻后，100℃或沸水浴加熱15分鐘。加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出。如果使用加熱塊(Heat block)進(jìn)行加熱注意用重物壓緊離心管蓋；如果使用沸水浴，則需使用可把蓋子鎖死的離心管或螺旋蓋離心管，或用Parafilm封住離心管口，用針頭刺一小孔。最方便和準(zhǔn)確的加熱方法是使用帶有熱蓋并可以加熱0.5ml PCR管的PCR儀。
c. 水浴冷卻至室溫，1000g室溫離心10分鐘。取200微升上清加入到96孔板中，隨后用酶標(biāo)儀在532nm測(cè)定吸光度。如果不方便測(cè)定532nm的吸光度，也可以測(cè)定530-540nm之間的吸光度。可以設(shè)定450nm為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
d. MDA含量的計(jì)算：對(duì)于血漿、血清或尿液等樣品可以直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得MDA的摩爾濃度，對(duì)于細(xì)胞、或組織樣品，計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量后，可以通過單位重量的蛋白含量或組織重量等來表示最初樣品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg組織。
常見問題：
1. 沒有檢測(cè)到MDA。
可能樣品中MDA濃度過低，在檢測(cè)限之下。在檢測(cè)組織或細(xì)胞的MDA時(shí)，請(qǐng)注意使用更多的組織或細(xì)胞。并注意盡量不要稀釋樣品。
