總SOD活性檢測(cè)試劑盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應(yīng)，通過比色來檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。
本試劑盒采用經(jīng)典的氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法。通過黃嘌呤(Xanthine)及黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.)，將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜(formazan)，后者在560nm處有強(qiáng)吸收。而SOD可清除超氧陰離子，從而抑制了甲臜的形成。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明超氧化物歧化酶活性愈低，反之則酶活性愈高。據(jù)此通過比色分析就可以計(jì)算出超氧化物歧化酶活性水平。本試劑盒的檢測(cè)原理圖如下:

     圖1. 基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系和NBT的SOD酶活力檢測(cè)原理圖。XO：xanthine oxidase。本試劑盒的檢測(cè)不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細(xì)胞和組織樣品中含有內(nèi)源性的過氧化氫，會(huì)干擾SOD的檢測(cè)。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾。例如，對(duì)于SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品中添加高達(dá)0.1mM的過氧化氫時(shí)，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果仍無顯著影響。
本試劑盒可以檢測(cè)細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清等生物樣品中的SOD活性。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，半年有效。S0109-2 NBT需避光保存。
注意事項(xiàng)：
待測(cè)樣品-70℃可保存1個(gè)月。需注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致SOD部分失活。
細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，否則會(huì)干擾本試劑盒的檢測(cè)。
抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會(huì)使測(cè)定出來的吸光度顯著升高。此時(shí)盡管樣品沒有顏色，如果設(shè)置了使用說明中的空白對(duì)照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 樣品的準(zhǔn)備：
a. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集細(xì)胞，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS或生理鹽水洗滌1-2遍。沉淀用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動(dòng)勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測(cè)樣品。
b. 組織樣品的準(zhǔn)備：動(dòng)物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入4℃或冰浴預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴進(jìn)行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動(dòng)勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測(cè)樣品。
c. 血漿或紅細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟1a細(xì)胞樣品的制備方法，或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d.  上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測(cè)定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100微克蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)。
e. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測(cè)定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，可以-70℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. NBT/酶工作液的配制：按照每個(gè)反應(yīng)160μl的體積配置適量的NBT/酶工作液。均勻混合158μlSOD檢測(cè)緩沖液、1μl NBT和1μl酶溶液，即可配置成160μl NBT/酶工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的NBT/酶工作液。具體配置方法可以參考下表。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

b.反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制：把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)融解后混勻，按照每1μl反應(yīng)啟動(dòng)液(40X)加入39μl SOD檢測(cè)緩沖液的比例進(jìn)行稀釋，混勻后即為反應(yīng)啟動(dòng)工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
c. (可選做)SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測(cè)中可以各取20微升，參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。說明：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用；本試劑盒對(duì)于SOD的檢測(cè)并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照或作為對(duì)SOD活性定量的參考。
3. 樣品測(cè)定：
a. 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。并按下表依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對(duì)照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對(duì)照3。
b. 37℃孵育30分鐘。說明：孵育25至35分鐘檢測(cè)出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測(cè)結(jié)果的一致性，推薦孵育30分鐘。
c. 在560nm測(cè)定吸光度，可以選擇設(shè)定600nm (或600nm以上，如650nm)作為參比波長(zhǎng)(也稱參考波長(zhǎng))，560nm吸光度的讀數(shù)扣除參比波長(zhǎng)的吸光度讀數(shù)即可作為實(shí)測(cè)讀數(shù)。
4. 樣品中總SOD活力的計(jì)算：
a. 抑制百分率的計(jì)算：
參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率：
抑制百分率＝[(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)－(A樣品－A空白對(duì)照3)]/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A空白對(duì)照2 = A空白對(duì)照3，此時(shí)可以把計(jì)算公式簡(jiǎn)化為如下形式(簡(jiǎn)化時(shí)可以不設(shè)置空白對(duì)照3)：
抑制百分率＝(A空白對(duì)照1－A樣品)/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%
如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測(cè)定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果測(cè)定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測(cè)定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測(cè)樣品。
b. SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。
c. SOD酶活力的計(jì)算：

圖2. 本試劑盒對(duì)SOD標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果。圖A縱坐標(biāo)ΔA560為孵育30分鐘后，空白對(duì)照1與SOD標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA560 (圖A)及抑制百分率(圖B)呈非線性關(guān)系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關(guān)系(圖C)。圖中數(shù)據(jù)僅作參考，實(shí)際測(cè)定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距可能會(huì)因具體反應(yīng)條件的不同和上圖有較明顯的差別。

SOD酶活力的計(jì)算公式如下：
待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝檢測(cè)體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units
例如，當(dāng)抑制百分率為50%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d. 如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1：SOD酶活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線，然后根據(jù)樣品檢測(cè)到的抑制百分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。
附2：SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時(shí)在560nm連續(xù)測(cè)定吸光度30分鐘。根據(jù)30分鐘內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率：
抑制百分率＝[(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)－(斜率樣品－斜率空白對(duì)照3)]/(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)×100%
其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測(cè)和計(jì)算更加精確一些，但檢測(cè)起來相對(duì)要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。

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