EMSA/Gel-Shift試劑盒(EMSA/Gel-Shift Kit)是用于EMSA(也稱(chēng)gel shift)研究的一個(gè)試劑盒。通過(guò)EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的結(jié)合情況，從而可以研究細(xì)胞內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子的激活水平。本試劑盒提供了進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)的探針標(biāo)記、蛋白和DNA結(jié)合以及EMSA上樣等的主要試劑，使EMSA實(shí)驗(yàn)變得簡(jiǎn)單方便。
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的濃度經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以很好的消除蛋白和標(biāo)記探針間的非特異性結(jié)合，同時(shí)又不會(huì)減弱目的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針間的結(jié)合。
每個(gè)EMSA/Gel-Shift試劑盒足夠標(biāo)記10-20次探針，足夠進(jìn)行100個(gè)蛋白和探針的結(jié)合反應(yīng)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 包裝 |
| GS002-1 | T4 Polynucleotide Kinase | 100U |
| GS002-2 | T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) | 100μl |
| GS002-3 | Nuclease-Free Water | 1ml |
| GS002-4 | 探針標(biāo)記終止液 | 100μl |
| GS002-5 | 5M 醋酸銨 | 600μl |
| GS002-6 | EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 200μl |
| GS002-7 | EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色，10X) | 200μl |
| GS002-8 | EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X) | 200μl |
| GS002-9 | TE | 1ml/管，共2管 |
| — | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
需自備待標(biāo)記的EMSA探針，需自備用于探針標(biāo)記的同位素，需自備EMSA膠配制的相關(guān)試劑。
細(xì)胞核蛋白的抽提可以使用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。
如需做super-shift，需自備用于super-shift的抗體。
本實(shí)驗(yàn)涉及到同位素的操作，請(qǐng)嚴(yán)格按照同位素的相關(guān)管理?xiàng)l例進(jìn)行操作。
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. 探針的標(biāo)記：
(1)如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
| 待標(biāo)記探針(1.75pmol/μl) | 2μl |
| T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) | 1μl |
| Nuclease-Free Water | 5μl |
| [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) | 1μl |
| T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μl) | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4Polynucleotide Kinase，混勻。
(2)使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
(3)加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
(4)再加入89微升TE，混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo)記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。
(5)標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
2. 探針的純化：
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：
(1)對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇，混勻。
(2)在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過(guò)夜。
(3)在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
(4)在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過(guò)分干燥。
(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
3. EMSA膠的配制：
(1)準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺Ｗ詈眠x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。
(2)按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大)。
| TBE buffer(10X) | 1ml |
| 重蒸水 | 16.2ml |
| 39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) | 2 |
| 80% 甘油 | 625μl |
| 10% 過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate) | 150μl |
| TEMED | 10μl |
(3)按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。
4. EMSA結(jié)合反應(yīng)：
(1)如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)(預(yù)期的結(jié)果參見(jiàn)圖1)：
| 陰性對(duì)照反應(yīng)： | |
| Nuclease-Free Water | 7μl |
| EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 2μl |
| 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 | 0μl |
| 標(biāo)記好的探針 | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
| 樣品反應(yīng)： | |
| Nuclease-Free Water | 5μl |
| EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 2μl |
| 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 | 2μl |
| 標(biāo)記好的探針 | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
| 探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 2μl |
| 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 | 2μl |
| 未標(biāo)記的探針 | 1μl |
| 標(biāo)記好的探針 | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
| 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 2μl |
| 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 | 2μl |
| 未標(biāo)記的突變探針 | 1μl |
| 標(biāo)記好的探針 | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
| Super-shift反應(yīng)： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) | 2μl |
| 細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 | 2μl |
| 目的蛋白特異抗體 | 1μl |
| 標(biāo)記好的探針 | 1μl |
| 總體積 | 10μl |
(2)按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫（20-25℃）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。
注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺(jué)到無(wú)法上樣，可以在無(wú)色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。
5. 電泳分析：
(1)用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
(2)把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
(3)按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過(guò)30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
(4)剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開(kāi)兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái)。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡。
(5)在干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。EMSA的典型分析結(jié)果可以參見(jiàn)下面的圖1。
圖1.一個(gè)典型的EMSA/Gel-Shift分析圖
1,陰性對(duì)照反應(yīng)(標(biāo)記探針)；
2，常規(guī)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針)；
3,探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針)；
4,突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針)；
5,Super-shift反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體)。
