產(chǎn)品簡介：

Ø 組織線粒體分離試劑盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是用于快速便捷分離動物組織線粒體的試劑盒。

Ø 本試劑盒在分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，可用于研究細胞色素c等線粒體蛋白向胞漿的釋放。

Ø 使用本試劑盒分離獲得的線粒體純度較高，并且絕大部分分離獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能。因此本試劑盒分離得到的線粒體可以用于線粒體的生理功能等方面的研究。例如可以使用我司的YS2006線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)測定分離得到的線粒體的膜電位。

Ø 本試劑盒分離得到的線粒體也可以被試劑盒中的線粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

Ø 提供了兩種不同的線粒體分離試劑，適用于不同的組織樣品。

Ø 本試劑盒提供了用于組織消化的胰酶消化液，使對組織樣品的處理更加便捷。

Ø 如果每個組織樣品的重量為50-100mg，本試劑盒可以處理50-100個樣品。

包裝清單：

保存條件：

-20ºC保存，一年有效。其中胰酶消化液可以4ºC保存。

注意事項：

Ø 試劑盒中的試劑對于不同的實驗目的不必全部使用。

Ø 如果用于制備蛋白樣品，需自備PMSF，否則不必使用PMSF。PMSF(ST506)可以向我司訂購。PMSF一定要在線粒體分離試劑或線粒體裂解液加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

Ø 使用說明中的操作步驟按照組織重量為50-100mg進行說明，如果組織塊較大，可以按比例加大各溶液的使用量。

Ø 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4ºC進行，所用溶液需冰浴或4ºC預冷。

Ø 通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取600g和11,000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用1000g和3500g。

Ø 使用本試劑盒中的線粒體儲存液稀釋或儲存的線粒體樣品應及時使用，以免線粒體膜電位受影響。如果不能及時使用，建議在-80ºC保存。凍存后的線粒體樣品不推薦用于膜電位的檢測，但可以用線粒體蛋白或核酸的相關檢測。

Ø 如果出現(xiàn)本試劑盒中線粒體儲存液不夠用的情況，可以單獨訂購線粒體儲存液(C3609)。

Ø Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(P0006)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(P0006C)和BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)可以向我司訂購。

Ø 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1. 準備溶液：室溫融解試劑盒中的各種溶液，溶解后立即置于冰上并混勻。第一次使用時，把1.5ml PMSF(溶劑)加入到PMSF(晶體)中，溶解并混勻，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液-20ºC保存。如果最終目的是制備線粒體蛋白，根據(jù)樣品數(shù)量，取適量相應的線粒體分離試劑備用，在線粒體分離試劑加入到組織樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。取適量線粒體裂解液備用，在線粒體裂解液加入到線粒體樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 從軟組織(例如肝臟和腦)中分離線粒體：

a. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。

b. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進行稱重。用PBS洗滌組織一次。

c. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細小的組織碎片。

d. 加入10體積預冷的線粒體分離試劑A或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑A，在冰浴上進行勻漿，勻漿10次左右。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認為組織的體積接近80微升，此時需加入800微升線粒體分離試劑A。

e. 把勻漿在600g，4ºC離心5分鐘。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細胞的線粒體抽提得率會下降。

f. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4ºC離心10分鐘。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細胞的線粒體抽提得率會下降。

g. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。

注：如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12,000g，4ºC離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。該細胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，必須使用PBS或生理鹽水至少稀釋2倍，然后才能用BCA法或Bradford法進行檢測(須特別注意，標準品也需要配制在含有相應比例線粒體分離試劑的PBS或生理鹽水中)。

3. 從硬組織(例如心肌和骨骼肌)中分離線粒體：

a. 對于心肌組織采用線粒體分離試劑A，對于骨骼肌組織采用線粒體分離試劑B，對于其它類似組織可以優(yōu)先考慮使用線粒體分離試劑A，如遇到效果不佳的情況可以試用線粒體分離試劑B。

b. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。

c. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進行稱重。用PBS洗滌組織一次。

d. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細小的組織碎片。

e. 加入10體積預冷的PBS，冰浴3分鐘。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認為組織的體積接近80微升，此時需加入

800微升PBS。

f. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。

g. 再加入8體積預冷的胰酶消化液，冰浴20分鐘。

注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應的胰酶消化液。

h. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。

i. 加入2體積相應線粒體分離試劑，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。 注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約160微升線粒體分離試劑。

j. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。

k. 加入8體積預冷的相應線粒體分離試劑或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑，在冰浴上進行勻漿，勻漿20-30次。注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應的線粒體分離試劑。

l. 把勻漿在600g，4ºC離心5分鐘。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細胞的線粒體抽提得率會下降。

m. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4ºC離心10分鐘。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點是相同數(shù)量細胞的線粒體抽提得率會下降。

n. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。

注：如果希望獲得去除線粒體的細胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12,000g，4ºC離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細胞漿蛋白。該細胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，請參考步驟2g。

4. 線粒體的使用：

a. 如果用于完整線粒體的功能或酶活性研究，可以加入適量線粒體儲存液，重懸線粒體。通常每100mg組織獲得的線粒體可以用40微升相應的線粒體儲存液重懸，預期分離獲得的線粒體樣品的蛋白濃度為10-20mg/ml。該蛋白樣品可以直接使用Bradford法測定蛋白濃度或離心沉淀后裂解再用BCA法測定蛋白濃度。注：線粒體儲存液中含有的DTT會干擾BCA 法測定蛋白濃度。

b. 如果用于線粒體的蛋白分析，初始重量為50-100mg的組織樣品分離得到的線粒體樣品中可以加入150-200微升臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體。裂解后的線粒體可以用于PAGE、Western、IP以及線粒體中的一些酶活性的測定等。裂解后的蛋白樣品可以使用BCA法或去垢劑兼容型Bradford法測定蛋白濃度。

c. 如果用于雙向電泳，請使用適當?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。