生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒(Mycoplasma PCR Detection Kit)，是一種通過(guò)巢式PCR法(Nested PCR)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測(cè)試劑盒。

支原體(Mycoplasma)是最小、最簡(jiǎn)單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對(duì)細(xì)胞壁的許多常見(jiàn)的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)支原體無(wú)效；支原體大小介于細(xì)菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過(guò)0.22μm濾器，常規(guī)的過(guò)濾對(duì)支原體無(wú)效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營(yíng)養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。支原體的這些特征使細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中存在支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞的支原體污染已經(jīng)成為一個(gè)世界性的普遍問(wèn)題。
支原體污染可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的狀態(tài)，使細(xì)胞的基因表達(dá)、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減緩、分化和死亡異常，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。這些影響因素會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測(cè)非常重要。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見(jiàn)，必須通過(guò)特定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、發(fā)光法等特殊的生化檢測(cè)以及DNA熒光染色檢測(cè)等。上述檢測(cè)方法中，大多操作步驟相對(duì)比較煩瑣、靈敏性不高、不能區(qū)分支原體種類、需要特殊儀器或所需時(shí)間較長(zhǎng)。而PCR法操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單便捷，PCR擴(kuò)增后通過(guò)電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小大致預(yù)測(cè)至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序以確定具體的支原體種屬。
本支原體PCR檢測(cè)試劑盒是利用兩對(duì)引物通過(guò)巢式PCR法特異性擴(kuò)增支原體基因組DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的高靈敏度特異性檢測(cè)的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1引物，用于擴(kuò)增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條R2引物進(jìn)行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)。通過(guò)巢式PCR可以大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。本產(chǎn)品的檢測(cè)原理請(qǐng)參考圖1。

圖1. 支原體PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理圖。

本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測(cè)支原體污染。
本試劑盒提供了陽(yáng)性對(duì)照Control template，便于確定PCR檢測(cè)是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。
如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無(wú)污染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。如果有必要預(yù)防或去除支原體，可以使用專用的支原體預(yù)防或去除試劑(C0288、C0290、C0292、C0293)。
如果用于20μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進(jìn)行250次檢測(cè)。如果用于50μl的PCR反應(yīng)體系，本試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴(kuò)增目的基因序列超過(guò)1000萬(wàn)倍，在使用Taq酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
一般情況，1st PCR可以初步鑒定是否有支原體污染，但建議進(jìn)行2nd PCR以進(jìn)一步確認(rèn)。
本試劑盒不能檢測(cè)出人肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1. 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：
a. 需要用戶自己準(zhǔn)備的器材
(a) PCR擴(kuò)增儀。
(b) 瓊脂糖凝膠電泳裝置。
(c) 微量離心機(jī)。
(d) 無(wú)菌PCR管、離心管、槍頭及移液槍。
b. 試劑和檢測(cè)樣品準(zhǔn)備
(a)雙蒸水或超純水。
(b)2X PCR Master Mix (D7228)、Easy-Load™ PCR Master Mix (2X) (D7251/D7255/D7259)或者其它Taq酶及PCR所需的dNTP等。
(c)瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、電泳染料。
(d)樣品：用于檢測(cè)支原體污染的樣品是細(xì)胞接種后培養(yǎng)了3-6天的培養(yǎng)上清液，或者是培養(yǎng)液、血清；如果使用細(xì)胞懸液做樣品，則需要提取DNA后再進(jìn)行PCR。加入量一般為反應(yīng)體系1/10的量或更少。
2. 1st PCR反應(yīng)：
a. 融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將2X PCR Master Mix，例如Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內(nèi)。參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)：

注：Control template的推薦用量為1μl。
b. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30-35 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時(shí)保存): 4ºC forever
3. 2nd PCR反應(yīng)：：
a. 參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)：

b.  PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時(shí)保存): 4ºC forever
4. 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析：
a.  反應(yīng)結(jié)束后，取1st PCR及2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物各10μl，進(jìn)行電泳確認(rèn)擴(kuò)增有無(wú)片段及片段大小。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖請(qǐng)參考圖2。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹皇谴_定是否有支原體污染，1-2%的瓊脂糖凝膠電泳均可；如果需要確定片段大小并據(jù)此大致推測(cè)污染支原體的種類，優(yōu)先推薦使用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

圖2. 使用本支原體PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳示意圖。1、2、3是1st PCR產(chǎn)物；1#、2#、3#是相應(yīng)的2nd PCR產(chǎn)物。各泳道的模板分別是：1和1#，Control template；2和2#，支原體污染的細(xì)胞上清；3和3#，超純水。M為DNA marker。

b.  以不同種屬的支原體為模板，1st PCR及2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物的條帶大小不同，具體擴(kuò)增片段大小可參考下表。
本試劑盒確定可以擴(kuò)增的支原體種類及1st PCR和2nd PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度參考表：

注：本試劑盒主要用于檢測(cè)是否有支原體污染，但也可以通過(guò)1st PCR和2nd PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大致預(yù)測(cè)所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序以確定具體的支原體種屬。
5. 關(guān)于陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)：
a. 一方面陽(yáng)性對(duì)照Control template可以單獨(dú)使用，以確定PCR反應(yīng)體系是否能正常工作。另一方面，陽(yáng)性對(duì)照Control template也可以添加到樣品中，以確定樣品中是否含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template時(shí)，1st PCR的反應(yīng)產(chǎn)物是810bp，2nd PCR的反應(yīng)產(chǎn)物是590bp。
b. 如果陽(yáng)性對(duì)照Control template單獨(dú)使用時(shí)沒(méi)有獲得擴(kuò)增片段，提示PCR檢測(cè)體系存在問(wèn)題，需要考慮更換PCR反應(yīng)相關(guān)試劑。
c. 如果陽(yáng)性對(duì)照Control template單獨(dú)使用時(shí)獲得了預(yù)期的擴(kuò)增片段，而陽(yáng)性對(duì)照Control template添加到樣品一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)沒(méi)有獲得任何PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，提示PCR體系工作正常，但檢測(cè)樣品中存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。此時(shí)建議將檢測(cè)樣品進(jìn)行DNA抽提，再用提取的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。也可以嘗試將樣品用超純水或PBS適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)試，此時(shí)如果樣品中支原體的污染程度比較高，基本上不會(huì)影響檢測(cè)，但如果樣品中支原體的污染程度比較低，很可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度顯著下降。
d. 如果陽(yáng)性對(duì)照Control template單獨(dú)使用時(shí)獲得了預(yù)期的擴(kuò)增片段，而陽(yáng)性對(duì)照Control template添加到樣品一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)可能僅獲得支原體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或僅獲得陽(yáng)性對(duì)照Control template的擴(kuò)增產(chǎn)物，也可能同時(shí)獲得支原體和陽(yáng)性對(duì)照Control template的擴(kuò)增產(chǎn)物。其中一種模板量比較多時(shí)，通常更容易擴(kuò)增獲得哪種模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中一種模板特別多時(shí)，另外一種模板可能檢測(cè)不到明顯的擴(kuò)增。