細(xì)胞凋亡－DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)(Apoptosis, DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column)是目前最先進(jìn)的DNA Ladder抽提試劑盒之一。本試劑盒是針對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的核小體間DNA鏈斷裂而設(shè)計(jì)的�？梢苑浅Ｓ行У爻樘嶙钚∑�段為180-200bp的DNA ladder，同時(shí)又可以抽提到最大50kb左右的基因組DNA。

DNA ladder也稱DNA fragmentation，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。通常觀察到DNA ladder，就可以判定細(xì)胞發(fā)生了凋亡。
樣品首先被蛋白酶K消化，隨后加入適合DNA結(jié)合到純化柱上的緩沖液，然后加入到純化柱內(nèi)。通過(guò)高速離心，使DNA在穿過(guò)純化柱的瞬間，結(jié)合到純化柱上，隨后通過(guò)兩次洗滌去除各種雜質(zhì)，最后通過(guò)洗脫液把DNA洗脫下來(lái)。整個(gè)過(guò)程無(wú)需酚氯仿抽提，無(wú)需酒精沉淀，樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。
通過(guò)DNA純化柱方式抽提DNA ladder比用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易損失。
本試劑盒每次最多可以抽提20mg組織或200-350萬(wàn)個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞。樣品用量過(guò)多，反而會(huì)影響抽提效果。
試劑盒提供了RNase A，可以獲得不含RNA的高純度總DNA，排除了RNA對(duì)DNA ladder觀察造成的干擾。
純化柱對(duì)于DNA的最大容量約為30微克。通常每200萬(wàn)Hela細(xì)胞或500萬(wàn)淋巴細(xì)胞可以抽提得到15-25微克總DNA，每 25
mg 肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA，每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA，每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA。樣品的用量請(qǐng)勿超過(guò)純化柱的容量，樣品用量最好能保持在純化柱容量的70%或以下。當(dāng)然過(guò)少的樣品也不利于檢測(cè)到DNA ladder。
對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡檢測(cè)，通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞就足夠用于DNA ladder的抽提和檢測(cè)。
本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品。
包裝清單：

保存條件：
蛋白酶K-20℃保存，其余均室溫保存。一年有效。蛋白酶K室溫(15-25℃)存放一周，活力無(wú)明顯下降。
注意事項(xiàng)：
溫度較低時(shí)樣品裂解液A或樣品裂解液B中可能會(huì)有沉淀產(chǎn)生，屬正�，F(xiàn)象。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混勻后使用。
第一次使用前洗滌液I需添加7ml無(wú)水乙醇，洗滌液II需添加24ml無(wú)水乙醇，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。
本試劑盒需使用55℃或70℃水浴，請(qǐng)?zhí)崆白骱脺?zhǔn)備。
除特別說(shuō)明外，每次Vortex應(yīng)控制在5-10秒左右。
本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無(wú)需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中抽提并檢測(cè)DNA ladder
a．收集約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，離心沉淀，棄上清。加入200微升PBS，輕輕吹散或彈散細(xì)胞，使細(xì)胞重懸于PBS中。
需自備PBS。如果使用凍存的細(xì)胞沉淀，先把細(xì)胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS重懸細(xì)胞。
b．加入4微升RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置3-5分鐘。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。
e．加入200微升無(wú)水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果。加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正�，F(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需把純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時(shí)間延長(zhǎng)而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-100微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘。≥12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進(jìn)行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來(lái)的DNA量相對(duì)較少。
k．取部分抽提得到的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。如果細(xì)胞發(fā)生凋亡，即可觀察到典型的DNA ladder。電泳時(shí)一定要注意換用新鮮配制的電泳液，DNA凝膠也要用新鮮配制的電泳液配制并新鮮配制后使用。電泳時(shí)為獲取最佳的電泳效果使ladder充分分開，電泳速度宜適當(dāng)慢一些，凝膠宜適當(dāng)長(zhǎng)一些，而加樣孔宜更加扁平一些。選取適當(dāng)較薄的梳齒，往往會(huì)獲得更好的ladder電泳效果。
2.從動(dòng)物組織中抽提并檢測(cè)DNA ladder
a．取不超過(guò)25mg的組織(脾不超過(guò)10mg)，剪切成盡可能小的碎片，加入180微升樣品裂解液A。
請(qǐng)勿使用過(guò)多的樣品，過(guò)多的樣品會(huì)導(dǎo)致抽提效果下降。較小的組織碎片會(huì)使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可，但固定過(guò)的組織請(qǐng)參考后續(xù)的其它步驟進(jìn)行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時(shí)間因組織不同而有所不同，通�？稍�1-3小時(shí)內(nèi)完成。為方便起見，可以直接裂解過(guò)夜，裂解過(guò)夜對(duì)抽提效果無(wú)任何負(fù)面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應(yīng)該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過(guò)夜仍呈凝膠狀，說(shuō)明樣品用量過(guò)多，作為補(bǔ)救措施，可以把整個(gè)反應(yīng)體系放大一倍。
c．加入4微升RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置3-5分鐘。
d．最高速劇烈Vortex 15秒。加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后需立即Vortex混勻。加入樣品裂解液B后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會(huì)溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會(huì)形成凝膠狀物，此時(shí)需劇烈晃動(dòng)或Vortex樣品，以盡量破壞凝膠狀物。
e．轉(zhuǎn)步驟1.e，后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中抽提總DNA”1.e起的步驟。​