活細胞Caspase-3活性與Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(Caspase-3 Activity and Apoptosis Detection Kit for Live Cell)是基于新型的具有細胞膜通透性的Caspase-3/7綠色熒光底物GreenNuc™ Caspase-3 Substrate聯(lián)合細胞凋亡紅色熒光探針Annexin V-mCherry來檢測培養(yǎng)細胞中Caspase-3活性和細胞凋亡的紅綠熒光雙染試劑盒，可用于實時監(jiān)測活細胞中Caspase-3活性和凋亡情況。本試劑盒適用于流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測系統(tǒng)進行檢測。
細胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當(dāng)細胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調(diào)控的自殺保護措施，去除體內(nèi)非必需細胞或即將發(fā)生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
Caspase (cysteine-dependent aspartate-specific proteases)的全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于蛋白質(zhì)中，主要利用半胱氨酸(cysteine)側(cè)鏈選擇性地高效切割含有天冬氨酸(aspartate)的多肽底物，在介導(dǎo)細胞凋亡(apoptosis)過程中起重要作用，并參與細胞的炎癥、生長和分化等過程。Caspase-3也稱CPP32、Yama或apopain，屬于caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，是哺乳動物細胞中研究最多的一個caspase。Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶，可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly ADP-ribose polymerase)、ICAD (Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、proCaspase-6、7和9、gelsolin和fodrin等。這些由Caspase-3介導(dǎo)的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。同時Caspase-3還參與細胞核凋亡過程，如染色質(zhì)固縮(chromatin condensation)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。另外，Caspase-3對凋亡過程中的細胞起泡(cell blebbing)也起到了關(guān)鍵作用。
GreenNuc™ Caspase-3為耦合DNA綠色熒光染料的多肽DEVD，該底物中的DEVD是caspase 3/7的識別序列，并帶有大量負電荷。這些負電荷和DNA帶有的負電荷相互排斥，使底物中的DNA綠色熒光染料不能結(jié)合DNA，也就不能被激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光。最初沒有熒光的底物穿過細胞膜進入細胞質(zhì)，在凋亡細胞中被Caspase-3/7識別并剪切，釋放出活化的DNA綠色熒光染料分子�；罨腄NA綠色熒光染料分子遷移進入細胞核，與DNA結(jié)合后，形成GreenNuc™-DNA復(fù)合物，就可以被激發(fā)而產(chǎn)生明亮的綠色熒光。
在正�；罴毎�，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)位于細胞膜的近細胞質(zhì)面。而在凋亡細胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細胞表面即細胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細胞外部。在白細胞的凋亡過程中，白細胞表面的PS標記可以被巨噬細胞識別，從而最終被巨噬細胞吞噬。人血管抗凝血劑Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，分子量為35-36kDa，對PS具有高親和力。用帶有紅色熒光的mCherry標記的Annexin V (Annexin V-mCherry)染色細胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等熒光檢測設(shè)備非常簡單而直接地檢測到PS的外翻這一細胞凋亡的重要特征。需要指出的是對于發(fā)生壞死(necrosis)的細胞，由于細胞膜的完整性被破壞，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的PS也會被Annexin V-mCherry染色。本試劑盒不區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞，如有需要，可參考C1062 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒。
本試劑盒檢測的是GreenNuc™-DNA復(fù)合物的綠色熒光和Annexin V-mCherry紅色熒光，GreenNuc™-DNA的最大激發(fā)光波長為500nm，最大發(fā)射光波長為530nm；Annexin V-mCherry的最大激發(fā)光波長為587nm，最大發(fā)射光波長為610nm。GreenNuc™-DNA復(fù)合物和Annexin V-mCherry的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。
圖1. GreenNuc™-DNA復(fù)合物(綠色)和Annexin V-mCherry(紅色)的激發(fā)光和發(fā)射光光譜。
本試劑盒中檢測試劑配制后直接加入細胞中，孵育15-30分鐘后即可直接用于熒光顯微鏡、流式細胞儀或熒光酶標儀檢測等檢測系統(tǒng)進行定性或定量檢測。正常細胞不會被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色，Caspase-3活性高的凋亡細胞的細胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細胞會被Annexin V-mCherry染成紅色熒光。使用本試劑盒檢測Caspase-3/7活性和細胞凋亡的效果參考圖2。
圖2. 活細胞Caspase-3活性與細胞凋亡檢測試劑盒檢測BGC-823細胞(人胃癌細胞) Caspase-3活性和細胞凋亡的效果。正常狀態(tài)的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細胞不會被GreenNuc™和Annexin V-mCherry所染色(圖B-D)。TS誘導(dǎo)3小時后的BGC-823細胞在明場下的形態(tài)見圖E；細胞內(nèi)Caspase-3活性高的凋亡細胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細胞的細胞膜呈紅色熒光(圖F-H)。TS是由TNFα、SM-164組成的細胞凋亡誘導(dǎo)試劑(C0006S)。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。
本試劑盒檢測可以實時監(jiān)測細胞內(nèi)Caspase-3/7活性。傳統(tǒng)的Caspase活性檢測試劑盒，通常需要裂解細胞或組織樣品后進行顯色或熒光檢測；通過Western檢測Caspase本身和剪切后蛋白的表達情況，也只能檢測Caspase的表達情況，從一定程度上反應(yīng)酶活性；基于熒光標記的Caspase抑制劑的檢測技術(shù)(fluorochrome-labeled inhibitors of caspases, FLICA)可以進入活細胞檢測Caspase活性，但其熒光探針本身就是不可逆的Caspase抑制劑，所以無法在活細胞中實時監(jiān)測Caspase的活力。而本試劑盒中提供的熒光底物GreenNuc™ Caspase-3對細胞活性沒有明顯的抑制作用，不影響Caspase的表達，不抑制細胞的凋亡過程，有助于實時監(jiān)測細胞凋亡。
本試劑盒功能強大。使用本試劑盒檢測Caspase-3/7的活性的同時，可以實時觀察細胞核在凋亡過程中的形態(tài)學(xué)變化，還能夠檢測細胞凋亡過程中PS外翻這一經(jīng)典事件。在眾多凋亡的細胞內(nèi)，不同細胞可能處在不同階段并經(jīng)歷著凋亡過程中的不同事件，因而研究中很重要的一點就是能實時獨立地跟蹤這些事件，從而更好地了解事件之間的相互關(guān)系。本試劑盒可以通過熒光顯微鏡、流式細胞儀來研究這些不同事件的時間、空間關(guān)系。
本試劑盒小包裝C1077S和中包裝C1077M用于流式細胞儀分別可以進行20次和50次檢測；用于96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時分別可以檢測40次和100次，檢測體系體積為200μl時分別可以檢測20次和50次。實際檢測次數(shù)會因為檢測體系和使用的底物濃度而有所不同。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1077S-1 | Annexin V-mCherry | 100μl |
| C1077S-2 | GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM) | 20μl |
| C1077S-3 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 12ml |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C1077M-1 | Annexin V-mCherry | 250μl |
| C1077M-2 | GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM) | 50μl |
| C1077M-3 | Annexin V-mCherry Binding Buffer | 30ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。Annexin V-mCherry和GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)避光保存。
注意事項：
避免微生物污染，如有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-mCherry，最終導(dǎo)致染色失敗。
GreenNuc™ Caspase-3 Substrate不是很穩(wěn)定，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融(一般不要超過三次)。
用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry或GreenNuc™信號過強，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS (C0221A)將Annexin V-mCherry或GreenNuc™稀釋3-10倍后再進行檢測。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.對于懸浮細胞：
a.在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注：PBS重懸不能省略，該步驟起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-mCherry的結(jié)合。
b.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
c.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
d.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，孵育完畢后置于冰浴中。注：可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以適當(dāng)重懸細胞2-3次以改善標記效果。
e.隨即進行流式細胞儀檢測，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨染色時出現(xiàn)了過多的GreenNuc™ Caspase-3假陽性細胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
2.對于貼壁細胞：
a.在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞脫落為止，吸除胰酶細胞消化液，避免胰酶的過度消化。
b.加入步驟2a中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000×g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注：加入步驟2a中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-mCherry導(dǎo)致染色失敗。
c.取5-10萬重懸的細胞，1000×g離心5分鐘，棄上清，加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞。
d.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，孵育完畢后置于冰浴中。注：可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以適當(dāng)重懸細胞2-3次以改善標記效果。
f.隨即進行流式細胞儀檢測，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000×g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-mCherry Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-mCherry單獨染色時出現(xiàn)了過多的GreenNuc™ Caspase-3假陽性細胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-mCherry稀釋3-10倍后再進行檢測。
3.對于貼壁細胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a.選做：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，對于培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板的細胞進行離心，1000×g離心5分鐘。
b.吸除細胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。
c.加入194μl Annexin V-mCherry Binding Buffer。
d.加入5μl Annexin V-mCherry和1μl GreenNuc™ Caspase-3 Substrate (1mM)，輕輕混勻。
e.室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘。可以使用鋁箔進行避光。
f.隨即在熒光顯微鏡下觀察，GreenNuc™-DNA為綠色熒光(Ex/Em=500/530nm)，Annexin V-mCherry為紅色熒光(Ex/Em=587/610nm)。注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。
